论文部分内容阅读
伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种嗜神经的α疱疹病毒，引起猪的繁殖障碍和多种家畜与野生动物的致死性感染，严重危害世界养猪业的健康发展。一旦感染猪群即可在神经组织中建立潜伏感染。在潜伏感染期，在体内检测不到病毒粒子，也不向外排毒，而在应激因素的刺激下，潜伏感染被激活，重新产生感染性病毒粒子，导致动物再次发病，并传播给其它动物。疫苗免疫只能预防动物不发病，但不能阻止PRV潜伏感染的建立与重新激活，因此潜伏感染是伪狂犬病根除计划的重要障碍。 疱疹病毒潜伏感染的发生、维持与激活的机理尚不清楚。研究发现，疱疹病毒在潜伏感染期产生一种“潜伏感染相关转录物（latency-associated transcript，LAT），其与潜伏感染之间的关系还不清楚。在PRV基因组中，LAT与病毒复制必需的早期基因IE180及EP0反向重复，因此，采取传统基因突变技术不能分别研究这些基因的功能及其与潜伏感染的关系。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术的出现为疱疹病毒潜伏感染的研究提供了有力的手段，该技术可在不影响基因组结构的情况下在RNA水平调控基因的表达，从而成为研究基因功能的用力工具。EP0基因是PRV的早期基因，它与PRV的立即早期基因IE180一起调节病毒的复制。因此，研究EP0基因的时空表达对解析PRV复制与潜伏感染的机理具有重要的参考意义。 本研究首先在大肠杆菌中高效表达了EP0基因，并用纯化的表达产物免疫家兔，制备了多克隆抗体，建立了Western-blot方法，为PRV复制和潜伏感染过程中EP0基因表达的研究奠定了基础。 本研究按照美国Ambion公司建议的siRNA分子设计原则（www.ambion.com），设计并合成了3个针对PRV Ea株EP0基因的siRNA模板EP04、EP08和EP12，分别克隆到siRNA表达载体pSilencer 4.1-CMV neo的CMV启动子下游，构建相应的重组表达质粒p4.1-EP04、p4.1-EP08和p4.1-EP12。同时，将EP0基因的编码区克隆到真核表达载体pEGFP-N3中，按照读码框架与EGFP基因的5’端融合，获得重组表达质粒pEP0-EGFP。将p4.1-EP04、p4.1-EP08、p4.1-EP12和阴性对照质粒p4.1-NK分别与pEP0-EGFP共转染IBRS-2细胞，荧光显微镜观察、流式细胞仪和半定量RT-PCR检测结果表明，三个siRNA分子均能不同程度地特异性抑制EP0基因的表达，抑制效率从高到低依次为EP08、EP12和EP04。 最后，研究了上述3个siRNA分子对PRV复制和EP0基因表达的影响。将siRNA表达质粒分别转染IBRS-2细胞，转染后22h接种PRV Ea株。细胞病变观察、TCID50测定、半定量RT-PCR检测和Western-blot分析结果表明，三种siRNA分子均能抑制PRV的复制和EP0基因的表达，mRNA水平和蛋白质水平的分析结果一致，抑