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纤维素酶(cellulase)是一组能将纤维素降解为葡萄糖的酶的总称,广泛存在于多种生物体内。在纺织、食品、造纸、可再生资源的利用等领域具有重要应用。目前工业中使用的多为中温纤维素酶,而对低温菌所产的低温纤维素酶研究相对较少。与中温纤维素酶相比,低温纤维素酶在常温下具有较高的酶活力和催化效率,可缩短处理过程的时间,并节省加热和冷却费用,使用温和热处理即可使该酶失活,不会影响产品的品质,具有较好的应用前景。 本研究以实验室分离纯化的一株耐冷菌HD1031为研究对象,对该菌株进行鉴定,并对其所产的纤维素酶进行分离纯化和酶学性质研究,主要研究结果如下: (1)根据ITS序列的特异性及保守性,利用通用引物ITS1和ITS4扩增该菌ITS序列。通过测序结果以及NCBI序列比对信息建立系统发育树。结合该菌的形态特征,确定HD1031为玫红假裸囊菌(Pseudogymnoascus roseus)。它可在4°C-25°C下生长,最适生长温度为16°C-17°C。 (2)以HD1031为产酶菌株进行低温发酵培养,可从粗酶液中检测出CMCase、滤纸酶(FPA)、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活力。其中CMCase、FPA、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活力分别为366.67U/mL、87.6U/mL、90.8U/mL和1234.5U/mL。 (3)对该菌所产的纤维素酶粗酶液进行性质研究表明:酶最适反应pH为6.0,最适反应温度为50°C,在室温条件下具有较高的稳定性,且pH稳定性较为广泛。在室温条件下该菌所产纤维素酶比本实验室保存的中温菌所产的酸性纤维素酶和中性纤维素酶水解滤纸的效率高。 (4)Native-PAGE显示该菌所产粗酶液包含两种CMCase。利用疏水柱Hitrap Phenyl HP和分子筛S-100对HD1031所产酶进行纯化,获得一个CMCase组分EG1和一个木聚糖酶组分X1。 (5)利用液相色谱-质谱联用仪对纯酶的SDS-PAGE电泳条带进行检测,比对结果表明NCBI数据库中不含有与EG1相似的序列。电印迹转膜后将EG1 N端测序,测序结果表明该酶N端封闭。 (6)对该菌所产的内切葡聚糖酶和木聚糖酶的性质研究表明:内切葡聚糖酶的最适作用温度为50°C,最适反应pH5.0,木聚糖酶的最适温度为50°C,最适反应pH为6.0。