本文主要是利用斑马鱼模型研究在心脏和肌肉中特异性高水平表达基因POP3在心脏发育中的调控与生物学功能。POP家族最早是从脊椎动物中分离出来的,它们蛋白大小约为300-360氨基酸,都含有非常保守的跨膜结构域,在跨膜结构域的C端膜内含有一个非常保守的Popeye结构域,而在跨膜结构域的N端有1-2个糖基化位点。目前已鉴定出的POP1、POP2和POP3三个成员在人类、鼠以及斑马鱼和爪蟾都有表达,而鸡没有POP2的表达。POP1、POP2和POP3在成年鼠的心脏和骨骼肌中有较高的表达,在肺中的表达较弱。在人类中,POP家族主要在骨骼肌和心脏中表达。研究表明,POP1蛋白能够形成二聚体,是一种粘附分子,参与细胞连接,在鸡的冠状血管发育过程中起重要的作用。但目前还没有关于POP2和POP3的功能研究报道,POP家族在发育以及出生后的个体中都有其独特的表达模式证明了它们在心脏发育中可能起着非常重要的作用。POP3基因定位于人类染色体6q21区段,共含有4个外显子,3个内含子,跨基因组序列长达22kb。有两个剪切体,第一个剪切体全长1848bp,ORF含有876bp,编码的蛋白质由291个氨基酸组成,分子量为34kDa。第二个剪切体全长1389bp,在第三个外显子中段比第一个剪切体少一段序列,引起无义介导的mRNA降解,不编码蛋白质。生物信息学分析表明,POP3含有三个跨膜结构域和一个Popeye结构域,该结构域中含有cNMP结合位点。我们制备了POP3抗体,用免疫印迹实验发现POP3在小鼠的心脏和肌肉组织中有高水平的表达,斑马鱼整胚原位杂交试验也表明POP3在心脏中有强表达。免疫荧光鼠细胞发现其主要表达于细胞质,在细胞核和细胞膜上也有表达,斑马鱼整胚抗体染色实验表明POP3表达于细胞核、细胞质和细胞膜中。通过morpholinos反义核苷酸敲减技术,我们发现敲低POP3的表达导致斑马鱼心脏不能正常环化,围心腔有不同程度的膨大,心脏的心室与心房并列排列。我们还采用了一种新型的心脏特异表达绿色荧光蛋白转基因斑马鱼Tg(nppa:gfp)作为模型,它能够更加清楚地显示出心脏表型,甚至心肌细胞的数目和形态。经过心脏数目的统计,并用生物统计学软件分析,发现这些心脏不能正常环化的胚胎心肌数目存在异常。测量心房与心室之间的瓣膜,发现这些心脏不能正常环化的胚胎瓣膜直径也缩小。这些都说明POP3参与了前心区心肌细胞的增殖调控。在大约5phf时的40%外包期,前心区心肌细胞迁移到便于观察的胚胎外层,通过胚胎抗体染色实验,抗体MF20和S46对心脏特异性蛋白MHC的荧光标记,检测到敲低POP3的表达能导致心脏前体细胞的减少。而敲减POP1或POP2时,未发现斑马鱼胚胎出现类似的心脏不能正常环化的畸形,说明POP1和POP2的生物学功能可能与POP3不同。通过免疫沉淀的方法,用POP3x抗体沉淀人类6月胚胎心脏组织蛋白,测定蛋白浓度后,还原烷基化并胰酶酶解质谱分析,得到与POP3相互作用蛋白ATF4,虽然ATF4还未被报道参与心脏发育的信号途径,但是它作为一个转录激活因子可能参与细胞的增殖调控。我们进一步用免疫共沉淀和哺乳动物细胞双杂交证明了POP3与ATF4相互作用的作用结构域,ATF4不与POP家族中的其它成员相互作用。GATA4作为心脏前体细胞的最早标志之一,在调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管等过程中发挥重要作用。已有报告指出,GATA4是细胞周期因子Cyclin D2和Cdk4的直接上游,它能够直接激活Cyclin D2和Cdk4基因的启动子上的GATA位点,所以GATA4是前心区心肌细胞增殖的必要因子。我们用免疫印迹检测发现用norpholinos反义核苷酸敲低POP3或ATF4都能致使心脏标记蛋白GATA4、NPPA等表达下降,也检测出用siRNA干扰技术敲低小鼠肌原细胞系的POP3或ATF4都能致使心脏标记蛋白GATA4、NPPA等表达下降。说明GATA4和NPPA等心脏标记基因很可能是POP3和ATF4的下游基因。于是我们用荧光报告系统分析和凝胶阻滞实验都说明了POP3和ATF4的相互作用,由POP3直接结合到GATA4基因启动子上的CRE位点进而调控GATA4的表达,及其参与的心肌前体细胞的增殖。在本人硕博连读的6年时间里,还做了其它的相关实验。通过酵母双杂交技术筛选获得与ZNF480相互作用的蛋白ACTC1。用RT-PCR和蛋白质组差异分析C2C12细胞模型,发现ZNF480稳定细胞系中的ACTC1在分化诱导之后表达上调,这说明ZNF480通过与ACTC1相互作用之后促进肌生成。另外还克隆了一个人类心脏发育候选基因C6orfl42,用RT-PCR实验分析它在人类7月龄胚胎的心脏组织中表达较强。对C6orfl42进行的初步转录活性研究说明它是一个转录抑制因子,在AP-1和P53信号途径中的抑制作用非常明显,并且用siRNA干扰C6orfl42之后,抑制作用有明显的减少。这些都说明C6orfl42有可能在心脏发育的过程中起着重要的作用。