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Tautomycetin (TMC)最初是从土壤链霉菌中分离得到的具有抗真菌活性的聚酮化合物。近几年又发现,TMC是蛋白磷酸酶PP1特异性抑制剂,具有免疫抑制活性,并且可以特异性抑制结肠癌细胞生长。但是,TMC抑制肿瘤细胞生长是否与其抑制PP1活性相关未得到证明,抑制肿瘤细胞生长的机制还未详细阐明。我们的前期实验发现TMC并不是特异性抑制结肠癌细胞生长,它对乳腺癌等多种细胞系具有显著生长抑制作用。本研究阐明了TMC的肿瘤细胞生长抑制活性与PP1抑制活性之间是否相关,并重点研究了TMC抑制乳腺癌细胞生长的信号通路,具体研究结果及结论如下：(1)采用MTT和磷酸酶PP1活性测定等方法,测定TMC及其不同衍生物的磷酸酶PP1抑制、肿瘤细胞生长抑制和免疫抑制活性。结果显示：多个衍生物具有较强的PP1抑制活性,却没有显著的肿瘤细胞生长抑制和免疫抑制活性；而部分衍生物具有较强的肿瘤细胞生长抑制活性,PP1抑制活性却不显著；TMC1μmol/L和衍生物TMC-F150μmol/L都能抑制MCF-7细胞内PP160%的活性,而对MCF-7细胞增殖的抑制率分别为90%和24%。表明TMC的肿瘤细胞生长抑制与免疫抑制活性不是通过其蛋白磷酸酶PP1抑制活性实现的。(2)采用MTT、Transwell细胞迁移和侵袭实验和流式细胞术等方法检测TMC对MCF-7细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。结果显示：TMC抑制MCF-7细胞增殖的ICso值为0.36μmol/L; TMC0.4μmol/L抑制MCF-7细胞迁移率和侵袭率分别为76%和79%；TMC0.5μmol/L诱导MCF-7细胞早期凋亡和晚期凋亡的比率分别为21%和34%；Western blotting检测TMC对凋亡相关蛋白表达。结果显示：TMC可以显著降低Bcl-2表达量和Bad磷酸化水平,提高Bax表达量和cytochrome-c线粒体释放量,caspase-9和caspase-7被活化。以上结果表明,TMC通过调控Bcl-2家族,依赖线粒体/细胞色素c介导的凋亡信号激活下游caspase级联通路,最终诱导MCF-7细胞凋亡。(3)采用MTT、流式细胞术和Western blotting等方法,检测TMC对耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR细胞增殖等影响。结果显示：TMC抑制MCF-7/ADR细胞生长的ICso值为1.26μmol/L; TMC1μmol/L诱导MCF-7细胞早期凋亡和晚期凋亡的比率分别为17.2%和28.4%；TMC同样可以显著降低Bcl-2蛋白表达量,激活caspase-9和caspase-7o以上结果表明,TMC对MCF-7/ADR细胞同样敏感,并通过依赖线粒体/细胞色素c介导凋亡通路诱导MCF-7/ADR细胞凋亡。(4)采用Western blotting、双荧光素酶报告基因等实验检测TMC对MAPK (ERK、p-38和JNK)、Wnt、p53和Akt信号通路相关蛋白磷酸化和转录因子活性的影响。发现TMC可以显著降低Akt及其下游调控蛋白FKHR的磷酸化,并且0.4μmol/L TMC使Akt下游调控的转录因子CREB转录活性降低70%；TMC同时可以显著抑制上游直接调控Akt的PDK1激酶磷酸化,但是对EGFR和HER2酪氨酸激酶受体磷酸化无显著影响。进一步观察转染Akt持续激活质粒myr-Akt对TMC抑制MCF-7增殖的影响。结果显示：0.5μmol/L TMC对转染空载体和myr-Akt质粒的MCF-7细胞的增殖抑制率分别为64%和31%。以上结果表明,TMC通过阻断MCF-7细胞中Akt信号通路,从而调控下游细胞生存和凋亡相关蛋白及转录因子活性。(5)通过siRNA技术将PP1基因沉默,检测对Akt磷酸化的影响。结果显示：PP1基因沉默并没有显著影响Akt激酶的磷酸化水平。以上结果进一步表明TMC抑制MCF-7细胞增殖与其抑制PP1活性无主要关联。(6)采用MTT、Western blotting和细胞转染等方法,检测TMC与Leptomycin B (LMB)联合用药是否具有协同效应及其机制。结果显示：LMB先加24h再加TMC共同作用协同效应较好,协同效应指数CI值为0.38-0.49；联合用药达到半数抑制时,TMC和LMB的用量分别为单独用药时的23.8%和17.7%；TMC和LMB联用可以增强TMC对Akt和FKHR等蛋白磷酸化的下调作用；LMB可以增强TMC诱导的FKHR细胞核聚集。以上结果表明,TMC与LMB联用对抑制MCF-7细胞增殖具有显著协同效应,协同效应与LMB促进TMC诱导的FKHR细胞核聚集有关联。综上,论文研究发现TMC的抗肿瘤活性与PP1抑制活性之间的相关性较低；阐明了TMC诱导MCF-7细胞凋亡的机制；证明Akt和FKHR抑制剂类药物与核输出抑制剂联用具有协同效应。研究工作为TMC药物机制提供了新的例证,为进一步确定TMC抗肿瘤的直接作用靶点奠定了基础；同时,为TMC联合用药提供了一个新的设计思路。