纤维素酶是由具有催化活性的催化区域（catalytic domain,CD）和具有底物结合能力的碳水化合物结合区（Carbohydrate-binding modules,CBMs）通过高度糖基化的连接区连接构成的。CBMs除了能够识别、吸附纤维素链之外,还能够与木质素非特异性的吸附,并且木质素与CBMs的吸附性非常强,但是纤维素酶不能降解木质素。因此如何降低纤维素酶与木质素的非特性吸附对提高纤维素酶降解活性、降低燃料乙醇生产成本具有重要意义。目前提高纤维素酶的酶活主要有两种方法:一是提高纤维素酶对纤维素的结合能力,二是降低木质素对纤维素酶的非特异性吸附。本论文实验内容主要包括以下几个方面:1)丝状真菌基于Tet-on和Cre-loxP系统遗传操作平台的构建有限的筛选标记限制了丝状真菌的多重遗传操作,因此建立一套可循环利用筛选标记的平台显得尤为重要。Cre-loxP系统被广泛用于循环利用筛选标记基因。Cre重组酶可以催化介于两个loxP位点之间的基因删除,从而实现筛选标记基因的循环利用。然而调控Cre重组酶的表达对于有效利用Cre-loxP平台至关重要。为了有效调控Cre重组酶的表达,我们引入了 Tet-on系统,将Cre编码基因置于Tet-on操纵子的下游。利用该系统,我们以抗硫胺耐药基因（pyrithiamine resistancegene,ptrA）作为筛选标记连续删除了连接酶D编码基因（ligase D,ligD）和β-葡萄糖苷酶Ⅰ编码基因（β-glucosidase I,bgll）两个基因,实现了ptrA的循环利用。因此利用ptrA作为筛选标记可在丝状真菌中进行多次基因工程操作,该系统将为丝状真菌遗传工程改造提供良好的平台。2)表面负电荷的增加对纤维素酶CBMs吸附性质的影响分析在本文中,我们首先将来自里氏木霉外切纤维素酶（cellobiohydrolase I,Cel7A）的 CBM 区通过 Cel7A 的 linker 与绿色荧光蛋白（green-florescent protein,GFP）相融合构建新的蛋白-GLC（GFP-Linker-CBM）。通过饱和突变技术,我们增加了 GLC表面的负电荷。结果表明,随着GLC负电荷的增加,GLC对酸不溶性玉米秸秆木质素（Acid Insoluble Corn Stover lignin,AICS-lignin）的吸附降低。与此同时,当我们在里氏木霉Cel7A的CBM区进行同样的突变后,Cel7A突变体对微晶纤维素的降解活性提高,并且这种提高作用不受木质素的影响。3)正电荷化学药品对CBMs吸附性质的影响分析由于电荷作用在木质素与CBMs吸附过程中发挥着作用,因此我们试图添加带有正电荷的化学药品降低AICS-lignin对GLC的吸附水平。我们选择了疏水性的阳离子表面活性剂十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）和正电荷强电解质的二甲基二烯丙基氯化铵（PolyDADMAC）。结果表明,DTAB或者PolyDADMAC的添加明显的降低了 GLC对AICS-lignin的吸附;同时正电荷化学药品的添加提高了GLC对微晶纤维素的吸附。在AICS-lignin存在时,添加DTAB或者PolyDADMAC后,Cel7A对微晶纤维素的降解活性得到提高。在添加0.2%DTAB时Cel7A水解效率提高了 34%。值得指出的是,增加DTAB或者PolyDADMAC同样提高了 Cel7A突变体的对微晶纤维素的水解活性。其中S14D突变体在含有0.15%的DTAB时对微晶纤维素的水解效率提高了 22.6%。