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脑水肿是缺血性脑血管病的基本病理变化之一，与疾病的预后密切相关，目前对脑水肿的治疗尚不能令人满意。近期研究发现AQP4(aquaporin-4)在脑组织水的运输中起关键性作用，缺血后脑内AQP4蛋白表达上调可能是缺血后脑水肿的重要诱发因素，抑制AQP4的表达为治疗缺血后脑水肿提供了新思路。RNAi(RNA interference)技术是近年来发展起来的高效特异的阻断基因表达的新手段，具有广泛的应用前景。由于中枢神经系统结构的特殊性，多数RNAi载体难以发挥作用，严重影响了RNAi的干扰效果。来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体(LV，lentiviral vector)可以通过整合携带shRNA(small hairpin RNA)感染包括神经元在内的非分裂细胞，而且感染效率高、免疫反应低，已广泛应用于神经系统基因功能研究和基因治疗中。本实验构建了针对大鼠AQP4基因的慢病毒RNAi载体，完成了病毒颗粒的包装，为进一步体内外研究阻断AQP4对脑水肿的影响奠定了理论依据和实验基础；采用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选测定了病毒滴度，建立了一种新的慢病毒滴度测定方法。目的：1．构建重组大鼠AQP4 shRNA的慢病毒载体质粒PLKO.1-puro-shAQP4，产生稳定表达大鼠AQP4 shRNA的浓缩慢病毒颗粒；2．探索一种准确、方便、快捷的慢病毒滴度测定方法。方法：1．设计并合成大鼠AQP4基因特异性的DNA寡核苷酸模板，退火后连接到经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的PLKO.1-puro载体质粒上，形成重组质粒PLKO.1-puro-shAQP4；转化大肠杆菌(escherichia coli，E．coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落、扩增后提取质粒，MluⅠ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定。2．将重组载体质粒PLKO.1-puro-shAQP4、包装质粒Δ8.2和包膜质粒VSV-G经转染试剂FuGENE6共转染293T细胞，产生稳定表达大鼠AQP4 shRNA的慢病毒颗粒，超速冷冻离心浓缩病毒颗粒。3．将病毒颗粒进行系列稀释后感染Eca9706细胞，采用嘌呤霉素最小致死量筛选病毒感染细胞的方法，进行慢病毒滴度测定。结果：1．设计并合成了2对寡核苷酸模板，重组到慢病毒载体质粒PLKO.1-puro中后，相应地筛选出2种阳性菌落。2．重组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro-shAQP4经过酶切和测序鉴定显示重组质粒构建成功。3．三质粒共转染293T产生出慢病毒颗粒，并进行了100倍浓缩。4．筛选出嘌呤霉素对Eca9706细胞的最小致死浓度为2.5μg／ml，应用该浓度测得浓缩后的病毒颗粒滴度为10~7TU／ml。结论：1．成功构建了大鼠AQP4基因特异性重组慢病毒载体质粒，并完成了病毒包装和浓缩，为进一步体内外研究阻断AQP4对脑水肿的影响奠定了基础。。2．建立了一种高效、方便、快捷的利用嘌呤霉素抗性筛选测定慢病毒滴度的新方法。