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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国华南地区的高发性恶性肿瘤,研究表明其发病除与EB病毒感染、化学致癌物有关外,与遗传易感基因也有密切的关系。近年来,RNA干扰(RNA interference,RNAi)的研究进展非常迅速,这项技术极有可能用于肿瘤临床治疗。本课题拟从基因治疗的角度,以人类端粒酶末端逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和凋亡抑制基因Bax inhibitor-1(Bi-1)为靶点,针对hTERI和Bi-1基因设计并构建表达shRNA的质粒载体,利用LipofectamineTM2000(Lip)有效地将其转染至鼻咽癌细胞内,诱导序列特异性的基因沉默,旨在研究RNAi效应对人鼻咽癌低分化细胞株CNE-2Z hTER7和Bi-1双基因表达的抑制作用及其对细胞增殖抑制和凋亡诱导作用,并将其与抑制单基因的作用效果相比较,探讨鼻咽癌新的治疗策略。
[方法]
根据本实验室以前筛选出的hTERT和Bi-1最佳作用位点(hTERT,gi:38201699,2475-2493位;Bi-1,gi:23271944,738-760位)分别设计合成2对shRNAs(TR和Bi-1),同时设计2对阴性序列(TRs和Bi-1s),退火、定向克隆入含T7启动子的真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)中,构建表达shRNA的系列重组质粒载体,研究其产生的shRNA抑制hTERT和Bi-1基因表达的效果,并观察其诱导鼻咽癌细胞凋亡的情况。琼脂糖凝胶电泳法初步筛选正确的重组克隆,DNA测序验证重组克隆的正确性;流式细胞术(FCM)检测转染率;MTT法观察质粒载体及转染试剂对CNE-2Z细胞生长增殖的影响;FCM检测细胞凋亡;Real-time PCR法分析表达shRNA重组质粒载体对hTERT和Bi-1基因mRNA表达的抑制效应,Western-blot分析重组质粒载体对相关基因蛋白质表达的抑制效果。Hoechst33258染色,荧光显微镜观察鼻咽癌细胞形态学的变化。
[结果]
DNA测序结果证实各重组质粒的插入转录模板完全正确。Lip对质粒的转染率为40％～48.6%。分别转染pcDNA3.1(+)和6种shRNA的重组质粒(TR、TRs、Bi-1、Bi-1s、TR-Bi-1、TRs-Bi-1s)后,TR、Bi-1和TR-Bi-1组的CNE-2Z细胞生长增殖能力降低,且TR-Bi-1组的生长增殖能力最低;凋亡细胞有所增加。转染TR、Bi-1和TR-Bi-1重组质粒48h后,荧光显微镜下可见部分鼻咽癌细胞出现典型的凋亡形态学变化;可明显下调hTERT和Bi-1的mRNA及蛋白表达水平;而pcDNA3.1(+)、TRs、Bi-1s、TRs-Bi-1s、Lip和空白对照组的mRNA和蛋白水平无明显变化。
[结论]
成功构建了针对人hTERT和Bi-1基因的shRNA真核表达质粒。构建的重组质粒能特异、有效地阻抑hTERT和Bi-1基因的表达,但其不能使hTERT和Bi-1基因完全沉默。虽然TR、Bi-1和TR-Bi-1都能发挥RNA干扰的作用,但是TR-Bi-1可以同时沉默hTERT和Bi-1两种基因,与沉默单基因的效果相比较,双基因沉默组鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖率受到明显抑制。TR-Bi-1组同TR、Bi-1组一样可显著下调hTERT或(或和)Bi-1基因mRNA及蛋白水平并可诱导人鼻咽癌细胞的凋亡。