前言：　　阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）是一种累积多系统和造成多器官损害的常见睡眠呼吸疾病。流行病学、临床及实验室研究证实，OSAS是2型糖尿病的独立危险因素[1，2]，且其作用独立于肥胖、糖尿病家族史及年龄等混淆因素[3]。　　OSAS患者在睡眠过程中，由于上气道反复塌陷，发生十分严重的反复窒息，导致OSAS的特征性低氧方式-间歇低氧(intermittent hypoxia，IH)，使患者整夜交替暴露于低氧张力(IH过程)和正常氧张力(即再氧合过程，reoxygenation，ROX)。间歇低氧的反复发生，会出现类似于缺血/再灌注过程中所出现的病理改变，产生过多的ROS，从而启动机体氧化应激[4]，因此目前OSAS被认为是一种氧化应激性疾病[5]。　　氧化应激同样在内分泌疾病研究领域已被证实是胰岛素抵抗、β细胞功能障碍和触发糖尿病的一个重要机制[6，7]。胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能紊乱是2型糖尿病最主要的两个病理生理缺陷，近几年的研究证实间歇低氧单因素即可以引起胰岛素抵抗且不依赖于自主神经系统的兴奋及肥胖因素的影响[8]，但间歇低氧对胰岛β细胞功能的影响很少涉及，而后者与胰岛素抵抗一样，是糖尿病发病中不可或缺的重要机制。研究发现胰岛β细胞内抗氧化酶系含量较其他细胞少[9]，而细胞对自由基损伤的易感性取决于细胞内抗氧化酶系的含量[10]，因而β细胞较其他细胞对氧化应激更为敏感，体内自由基产生过多或清除障碍更易导致β细胞损伤及糖尿病的发生[11，12]，因此我们依此对间歇低氧条件下的胰岛β细胞进行研究。　　目前，有许多抗氧化剂被研究并报道可减弱机体氧化损伤。褪黑素(MelatoninMT)是哺乳动物松果腺合成与分泌的主要激素之一，在生理及药理浓度均具有抗氧化的作用，并具有清除活性氧的能力，最近报道显示，褪黑素可以在体内外均影响胰岛素的分泌，减弱糖尿病的代谢紊乱和氧化应激状态[13];近年亦有MT与间歇低氧之间的研究，它可通过增加抗氧化酶的转录[14]及减少β-淀粉肽的产生[15]以减弱间歇低氧对大鼠海马的损伤;并可减轻间歇低氧诱导的微血管损伤及胰岛素抵抗[16]。　　本实验目的:(1)通过建立间歇低氧大鼠模型，观察间歇低氧对大鼠胰腺组织的影响，给予褪黑素干预观察其对间歇低氧条件下的大鼠的胰腺组织的保护作用;(2)体外培养大鼠β细胞系INS-1细胞，去除体内的其它影响因素，观察间歇低氧条件直接作用于细胞引起的细胞功能的改变，以及褪黑素对间歇低氧条件下的INS-1细胞的保护作用。　　方法：　　1、体内实验:　　28只雄性Sprague-Dawley(S-D)SPF级大鼠随机平均分为四组:常氧对照组（CON组）、间歇低氧组（IH组）、褪黑素干预组(MT组)和N-乙酰半胱氨酸干预组(NAC组)。常氧对照组于空气条件下饲养4周，余各组于间歇低氧设备内暴露8小时/天，4周;其中MT组及NAC组于暴露前30分钟分别给予MT及NAC干预处理。于0周、1周、2周、4周检测各组大鼠空腹血糖，暴露4周后检测各组大鼠血清胰岛素水平的变化;血清、胰腺组织匀浆中的氧化应激指标;实时荧光定量PCR法检测胰腺组织JNK1、PDX-1mRNA水平;免疫组化法检测胰腺中JNK1/2蛋白表达;Western Blot半定量分析胰腺组织磷酸化JNK1/2及总JNK1/2、PDX-1蛋白水平。　　2、体外实验:　　(1)间歇低氧条件下作用于大鼠β细胞系-大鼠INS-1细胞3天作为间歇低氧组细胞，常氧组细胞不进行低氧暴露，分别收集暴露不同时间段（1天、2天、3天）的培养上清及细胞，培养上清检测氧化应激指标，细胞进行实时荧光定量PCR检测JNK1mRNA表达水平，Western Blot检测磷酸化JNK1/2、总JNK1/2蛋白表达水平。　　(2)间歇低氧作用于大鼠INS-1细胞，给予SP600125阻断JNK蛋白活性，观察下游基因PDX-1 mRNA及蛋白变化。　　(3)细胞暴露于间歇低氧条件下，同时给予不同剂量褪黑素干预，观察褪黑素干预后培养上清氧化应激指标，及磷酸化JNK1/2、总JNK1/2变化。　　结果：　　1、间歇低氧可引起大鼠胰腺组织氧化损伤，抗氧化剂干预治疗可改善氧化应激状态　　经间歇低氧暴露4周后，IH组血糖从2周开始明显较其自身0周时增高（7.6±1.5mmol/L VS5.5±0.6mmol/L; P＜0.05），且与CON2w组相比较亦有明显增高（7.6±1.5mmol/L VS5.9±0.2 mmol/LP＜0.01）;MT2w组低于IH2w组血糖（7.6±1.5mmol/L VS6.2±0.8 mmol/L P＜0.05），MT4w明显低于IH4w组血糖（7.5±1.5mmol/L VS5.3±0.7mmol/L P＜0.01）。血浆胰岛素各组间未见明显差异(P＞0.05);氧化应激指标显示IH组血清及组织匀浆MDA较CON组明显增高(P＜0.01)，MT及NAC可使MDA降低(P＜0.01);IH组血清SOD活力虽然有所下降但与CON组比较无统计学意义，MT可使间歇低氧大鼠血清SOD活力增高，在胰腺组织匀浆中IH组SOD活力明显降低，低于CON组(P＜0.01)，MT、NAC均可引起SOD活力增强;IH组血清及组织匀浆GSH含量与CON组比较无统计学意义，但褪黑素可明显提高间歇低氧大鼠GSH水平，与IH组相比较(P＜0.05)。　　实时荧光定量PCR结果提示IH组胰腺组织表达JNK1mRNA水平明显高于CON组、MT组及NAC组(P＜0.01); MT组较IH组表达降低(P＜0.05); MT组与CON组相比无统计学意义(P＞0.05)，NAC组与IH组比较无显著差异(P＞0.05)，略高于CON组(P＜0.05)。间歇低氧并没有引起PDX-1mRNA水平明显下降，IH组与CON组间无显著性差异（P＞0.05），在褪黑素干预组可见PDX-1mRNA水平明显升高，但与CON组、IH组及NAC组间比较均无显著性差异(P＞0.05)。　　Western Blot分析提示大鼠胰腺组织中总JNK1/2，p-JNK2/t-JNK2各组间均无明显变化，p-JNK1/t-JNK1结果显示，间歇低氧组磷酸化JNK1表达明显增高，与CON组、MT组、NAC组比较有显著性差异(P＜0.01)。MT、NAC处理组与CON组相比较无明显差异(P＞0.05);间歇低氧可引起PDX-1蛋白水平下降（P＜0.01)，褪黑素(P＜0.01)及NAC(P＜0.05)均可逆转由间歇低氧所诱导的PDX-1蛋白下降，且与CON组相比较无明显差异（P＞0.05）。　　免疫组织化学结果直观地反映了，正常氧组细胞核内棕黄色颗粒少，间歇低氧组可见大量胰岛细胞内聚积棕黄色颗粒，褪黑素组及NAC组胞核浓染较间歇低氧组减少。　　2、体外细胞培养提示间歇低氧对大鼠INS-1细胞产生了氧化应激性损伤　　IH组随着间歇低氧暴露时间的延长，细胞培养上清液中MDA含量呈进行性增高，1天组与2、3天组间有显著性差异(P＜0.01)，2天组与3天组间无明显差异(P＞0.05);不同时程细胞培养上清液SOD活力进行性降低，各组间均有显著性差异(P＜0.01)。间歇低氧条件下不同时程的细胞表达JNK1mRNA较相应时间CON组明显增高(P＜0.05)，随时间变化其表达量进行性下降，IH3d与IH1d组间比较有统计学意义(P＜0.05)。JNK1/2总蛋白量亦未随时间延长而增加，而磷酸化JNK1于IH3天组呈现出高表达。　　3、阻断磷酸化JNK蛋白活性可改善间歇低氧对PDX-1蛋白的抑制　　Real Time PCR结果分析提示间歇低氧可引起PDX-1mRNA下降，给予SP600125阻断JNK蛋白活性，未能完全扭转PDX-1mRNA表达水平升高到正常组水平。Western Blot对蛋白进行分析呈现出不同的结果，IH组PDX-1蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)，阻断JNK蛋白活性后PDX-1蛋白明显增高与CON组相比较无显著性差异。　　4、抗氧化剂干预　　不同剂量褪黑素（10nM、1μM、100μM）干预间歇低氧条件下的INS-1细胞显示，随着褪黑素剂量的增加，培养上清MDA的含量呈下降趋势，与IH组相比较，MT及NAC均可降低培养上清MDA的含量(P＜0.01)，其中MT100uM组可将MDA降至与CON组相当的水平(P＞0.05)。随着褪黑素剂量的增加，培养上清SOD活力呈上升趋势，与IH组比较，MT及NAC均可升高SOD活力(P＜0.01)，其中MT100uM组可将SOD活力提升至与CON组相当的水平(P＞0.05)。　　Western Blot对蛋白进行半定量分析提示:CON组与IH组、MT10nM组、NAC组间有统计学意义（P＜0.05）;IH组与CON组、MT100μM组有统计学意义(P＜0.05); MT100μM组磷酸化JNK1表达明显下降且与CON组无明显差异，NAC与IH组间无统计学差异(P＞0.05)。　　结论：　　1、间歇低氧可以诱导机体产生氧化应激。　　2、间歇低氧所诱导的氧化应激通过增强JNK1mRNA表达，同时加强磷酸化JNK1蛋白的表达（而非JNK2），使PDX-1蛋白表达下降（而PDX-1mRNA并未受到影响），进一步影响胰岛细胞的功能。　　3、褪黑素发挥了其强大的抗氧化作用，并通过抑制JNK1mRNA表达及JNK1磷酸化使PDX-1蛋白表达升高，进一步保护了胰岛细胞的功能。　　4、间歇低氧可以直接引起INS-1细胞氧化损伤，且这种损伤，随着暴露时间的延长而加重。其诱导的氧化应激，可能是通过诱导JNK1转录水平及蛋白活化而实现的。　　5、阻断JNK蛋白的活性可以减轻间歇低氧作用对PDX-1mRNA及蛋白表达的抑制作用。　　6、MT100μM可以降低间歇低氧对INS-1细胞的氧化损伤，并可能是通过抑制JNK1的转录及蛋白活化而实现的。