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牙菌斑生物膜是黏附于牙面或修复体表面的微生物团块,不能被水冲去或漱掉。生物膜的形成可增加细菌抵抗宿主防御的功能、降低抗生素的杀灭作用,并使各种细菌能在合适的微环境中发挥不同的致病作用。变异链球菌是公认的主要致龋菌,它以生物膜的方式生长,通过密度感应系统(quorum sensing,QS)根据周围环境变化来进行自身调节,以便更好地适应生存环境。通过感受刺激多肽(competence stimulating peptide,CSP)介导的变异链球菌的QS系统参与调节生物膜的形成、糖代谢、耐酸能力以及多种毒力因子的分泌,对变异链球菌在复杂的口腔环境中生存有重要的意义。大肠杆菌素Ia是大肠杆菌分泌的一类细菌素,可以作用于细胞膜的脂质双分子层,通过其C端的通道结构域,形成电压依赖性离子通道,致使靶细菌崩解、死亡。本课题将编码大肠杆菌素Ia通道结构域的基因(Colicin Ia channel domain)与编码变异链球菌CSP的基因重组,制备出Colicin Ia channel domain-CSP融合蛋白并纯化出抗变异链球菌多肽,通过生物学活性的分析进一步评估此抗菌肽的作用,以期为龋病的防治寻找一条新的途径。本研究分为三部分:第一部分大肠杆菌素通道结构域(Colicin Ia channel domain)与变异链球菌感受刺激多肽(CSP)基因重组和序列测定根据在GenBank中登录的Colicin Ia channel domain的完整的DNA序列,设计一对引物,采用PCR的方法从装载了大肠杆菌素Ia(Colicin Ia)的宿主菌中扩增得到Colicin Ia channel domain全长序列,将其克隆入带有麦芽糖结合蛋白(MBP)的pMAL-c2x载体中,并且将合成的变异链球菌感受刺激多肽(CSP)的核酸片段,经退火后也连入此载体中,经测序证实无碱基突变或缺失。第二部分重组质粒pMAL-c2x-Colicin Ia channel domain-CSP在大肠杆菌中诱导表达及分离和纯化将含有pMAL-c2x-Colicin Ia channel domain-CSP的重组质粒转化大肠杆菌BL21后,通过IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE显示在约62KD处有预期的条带。对不同IPTG浓度和诱导时间的融合蛋白表达率分析结果表明:不同IPTG浓度对表达量无明显差异,诱导4小时表达量达高峰。将菌体进行超声波破碎细胞,离心收集上清液。将上清液经直连淀粉亲和树脂纯化后,收集洗脱液得到目的蛋白。融合蛋白经Factor Xa裂解为麦芽糖结合蛋白和抗变异链球菌多肽。裂解蛋白液过SP阳离子层析柱,以SDS-PAGE检测,纯化蛋白为单一条带,大小约19.3KD,与理论值接近。第三部分抗变异链球菌多肽生物学活性分析抗变异链球菌多肽进行抗菌实验检测其生物学活性,证明此多肽有抑菌作用,对变异链球菌的抑制能力较强,而对血链球菌和远缘链球菌的抑菌作用相对较弱。