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[目的]嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)治疗和程序性细胞死亡受体1(PD-1)/程序性细胞死亡配体1(PD-L1)免疫监测点抗体封闭手段已经成为肿瘤免疫治疗领域两大最具应用前景的治疗方法。虽然CAR-T细胞治疗在B细胞来源急性淋巴细胞白血病(B-ALL)治疗中已经取得了不错的治疗效果,但是回输患者体内的CAR-T细胞杀伤活性仍会被PD-1/PD-L1免疫抑制性途径所削弱。能否通过联合PD-1抗体封闭或PD-1下调来打破PD-1/PD-L1免疫抑制性途径对CAR-T细胞活性的限制作用,以进一步提高CAR-T细胞治疗效果?再者,这种联合会不会带来严重毒副作用?这方面研究尚未在B-ALL中有研究报道。因此,我们开展了PD-1抗体封闭或PD-1下调联合抗CD19 CAR-T细胞治疗B-ALL的临床前安全性和有效性研究。此外,考虑本课题为一项应用性课题,我们计划在临床前实验基础上开展一项有关抗CD19 CAR-T细胞治疗化疗复发或难治性B-ALL患者的I期临床试验,用于初步评估抗CD19 CAR-T细胞输注的安全性和有效性。[方法]我们基于microRNA 148a骨架结构利用前期已验证的PD-1 siRNA序列设计了PD-1的人工microRNA序列,在此基础上,采用合成的抗CD19CAR序列、PD-1人工microRNA序列和非靶向对照(NC)人工microRNA序列构建三种逆转录病毒主质粒,并进行相应的逆转录病毒包装和浓缩;原代人外周血单个核细胞病毒感染前先用可溶性CD3/CD28抗体活化3天,再采用离心法进行逆转录病毒感染;流式细胞术用于检测细胞表型如CAR、PD-1、PD-L1、CD3、CD19、CD25、CD45RA/RO、CD62L等表达;PD-1蛋白下调效果用蛋白印迹和流式细胞术进行检测;在PD-1抗体体外封闭实验中,PD-1封闭抗体或IgG同型对照抗体体外先与T细胞孵育24小时,再进行后续功能实验;T细胞体内外功能实验采用流式细胞术、流式微球分析技术和以NALM-6白血病建立的B-ALL NPG/Vst小鼠模型进行;在临床试验中,抗CD19 CAR-T治疗化疗复发或难治B-ALL患者的安全性和有效性采用NCI通用不良事件术语标准3.0版、流式细胞术、Q-PCR、流式微球分析技术和骨髓形态检测等来进行观察和评估,所有试验方案均经我院伦理委员会批准后进行。[结果]我们成功构建了三种抗CD19 CAR逆转录病毒载体(pRV-19-28ζ、pRV-iPD-1-19-28ζ和pRV-NC-19-28ζ),并经测序鉴定,蛋白印迹和流式细胞检测结果均证实PD-1人工microRNA能特异性和有效下调PD-1蛋白表达;我们对RV-19-28ζ感染原代人T细胞所制备的抗CD19 CAR-T细胞体外扩增和细胞表型变化特点进行了研究,并发现病毒感染不利于T细胞扩增和给予抗CD19 CAR-T细胞再刺激能明显增加CAR-T细胞比例,而且感染后T细胞表型在体外培养过程中处于动态变化的,但这种变化并不是由于逆转录病毒感染所致;基于靶细胞(NALM-6、OCI-Ly10和K562)的流式细胞细胞毒性检测技术显示抗CD19 CAR-T细胞具有CAR特异性和剂量依赖性杀伤靶细胞活性;然后,我们发现肿瘤细胞和T细胞体外共孵育后能上调总T细胞和抗CD19 CAR-T细胞表面PD-1蛋白表达,以及不同程度地上调B细胞肿瘤Raji、OCI-Ly10和NALM-6表面的PD-L1蛋白表达,其中NALM-6细胞表面PD-L1蛋白上调最为明显;在此基础上,我们体外研究首次证明PD-1抗体封闭能增强抗CD19CAR-T细胞对NALM-6、Raji和OCI-Ly10靶细胞的细胞毒性作用。进一步,我们又研究了PD-1下调对CAR-T细胞杀伤NALM-6靶细胞的杀伤效应的影响,结果同样表明:PD-1下调能增强抗CD19 CAR-T细胞杀伤活性;但我们发现PD-1抗体封闭并不能增强抗CD19 CAR-T细胞与NALM-6肿瘤细胞共孵育后IFN-γ的分泌,而PD-1下调能显著增强抗CD19 CAR-T细胞的IFN-γ分泌;更为重要的是,动物实验结果显示:PD-1抗体封闭或PD-1下调联合抗CD19 CAR-T细胞在B-ALL模型(NALM-6)中虽然没有导致严重毒副作用,但是无法延长小鼠生存时间和发病时间;在动物实验基础上,经我院伦理委员会批准我们开展了抗CD19 CAR-T治疗化疗复发或难治性B-ALL患者的I期临床试验,目前已经完成了3例患者的抗CD19 CAR-T细胞输注。初步治疗结果显示:2例患者对CAR-T治疗产生了反应,达到完全缓解,1例患者治疗失败。其中2例治疗有效患者中有1例患者治疗后产生了细胞因子释放综合症,该患者血清中IL-6和CRP治疗前后急剧变化,体温升高,后经2次托珠单抗和1次地塞米松联合治疗得以缓解。而且,这例患者接受的CAR-T细胞是半相合供者的外周血T细胞制备而成,输注后未产生GVHD反应。[结论]PD-1抗体封闭或PD-1下调联合抗CD19 CAR-T细胞输注在BALL模型中虽然安全性较好,但是无法进一步增强抗CD19 CAR-T细胞体内抗B-ALL效应;抗CD19 CAR-T细胞输注能在化疗复发或难治B-ALL患者中诱导产生临床反应,临床不良反应主要有细胞因子释放综合症,托珠单抗联合地塞米松能有效缓解细胞因子释放综合症,血清中200 mg/L浓度水平的CRP能用于细胞因子释放综合症发展进程的预测。