小麦孢囊线虫LAMP检测方法的建立及应用

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小麦孢囊线虫是全世界禾谷类作物上的重要病原线虫,每年给小麦的生产造成严重的经济损失。小麦孢囊线虫病是我国小麦生产上的一种新的具有潜在威胁性的线虫病害,严重威胁着我国的小麦生产安全。禾谷孢囊线虫群体构成非常复杂,目前已知禾谷孢囊线虫组包含12个有效生物种和一些未知种,不同种类的禾谷孢囊线虫对小麦的致病性有所不同。因此,对禾谷孢囊线虫种类进行准确的鉴定不仅是从事禾谷孢囊线虫研究的基础,也对防治小麦孢囊线虫病具有重要意义。本研究以禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫为研究对象,根据RAPD特异性片段分别设计LAMP引物,建立LAMP检测体系,对反应体系中的甜菜碱、Mg2+、dNTPs的浓度以及反应时间、反应温度等因素进行优化,并进行特异性和灵敏度试验,同时对田间实际样品进行鉴定。经优化后的禾谷孢囊线LAMP反应体系为:0.4μmol/L外引物,2.8μmol/L内引物,0.4μmol/L环引物,3.2mmol/L dNTPs,3mmol/L Mg2+,0.32U/μL BstDNA聚合酶大片段,不添加甜菜碱;菲利普孢囊线虫LAMP反应体系为:0.4μmol/L外引物,2.8μmol/L内引物,0.4μmol/L环引物,1.6mmol/L dNTPs,5mmol/L Mg2+,0.32U/μL BstDNA聚合酶大片段,不添加甜菜碱。反应程序为:63℃75min,85℃10min。将单条小麦孢囊线虫(禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫)DNA按10倍浓度梯度稀释,并与普通PCR方法进行比较,结果表明本研究建立的LAMP体系检测灵敏度达到1/20000条线虫DNA,比普通PCR灵敏100倍。与常见的植物寄生线虫大豆孢囊线虫、豌豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、香蕉穿孔线虫、象耳豆根结线虫等均无交叉反应,说明此体系的特异性较强。同时本研究建立的LAMP检测技术可以用于土壤和受侵染小麦根系的直接检测,对小麦孢囊线虫病的早期诊断具有重要意义。以上结果表明,LAMP检测方法特异性强、灵敏度高,是鉴定禾谷孢囊线虫的有效手段。且LAMP法操作简便、设备要求简单、费用较低,适合基层部门的使用。
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