研究背景近十年来,人们已经认识到细胞表面糖链与蛋白质的相互作用促进了细胞与细胞间的黏附,参与了脊椎动物胚胎发育。这种与糖链相互作用的蛋白被称为糖结合蛋白(glycan-binding protein,GBP)。GBP通过和糖蛋白糖链或糖脂糖链的相互作用调控细胞识别、信号传递、细胞内吞以及细胞生长、分化和凋亡等生物学行为。肿瘤发生时,蛋白质和脂分子糖基化的异常导致糖链发生了结构和数量的改变,相应地和这些糖链相互作用的GBP的表达也发生异常改变。GBP在生物学进程中扮演着十分重要的角色。但是目前仍然缺乏简便并能够用于糖链与蛋白质之间相互识别、相互作用的高通量研究方法。特别是缺乏类似于DNA芯片和蛋白质芯片的研究工具,如与此相类似的糖芯片的研究,目前国际上仍处于探索阶段。糖芯片技术平台的建立将为高通量研究蛋白质与糖链作用的关系提供有效的工具。研究目的研究制备糖芯片的新技术;建立糖芯片应用平台体系,应用于糖链与蛋白质之间相互识别、相互作用的研究。实验方法采用了两种方法来制备羟基衍生化的玻片,通过糖链还原末端的半缩醛基与玻片表面的羟基形成糖苷键使糖链共价固定在玻片的表面:首先,玻片分别被环氧化和氨基化,然后用不同的表面化学修饰方法使玻片表面羟基化。利用羟基衍生化的玻片制备出糖芯片。研究结果开发出了一种新的便捷有效的方法来制备糖芯片,即利用了糖链的还原末端,以糖苷键的形式共价偶联其到羟基(-OH)衍生化的玻片上,较好模拟了糖链在细胞表面的天然存在状态,生物活性稳定。这种制备糖芯片的新技术固定糖链的共价连接方式简单、快速、成本较低、实用。1.利用羟基化的玻片表面制备出了糖芯片,荧光标记的凝集素可以与糖芯片上固定的糖链特异性地结合,用于检测糖链在玻片上的固定效果。通过实验确定了4-羟基丁酸肼作为偶联剂修饰环氧化玻片,使玻片表面羟基化。优化了糖芯片技术平台的体系,确定了最佳的实验条件:a.最佳点样液是醋酸钠缓冲液。b.最佳封闭剂是3%Top Block。c.最佳孵育液是中性或者弱碱性的磷酸盐缓冲液。d.最佳孵育时间为一个小时,最佳孵育温度为4℃。e.最佳点样浓度为1 mmol/L。f.糖芯片储存条件为4℃。2.应用所建立的糖芯片技术平台体系研究了肝脏相关糖结合蛋白,通过实验研究肝脏相关糖结合蛋白在不同的发育阶段以及不同样本中的分布差异以及丰度差异,为进一步研究肝脏中糖结合蛋白奠定了基础。3.应用所建立的糖芯片技术平台体系对健康人血清进行了抗糖抗体谱的初步研究,通过实验可知19种糖链在人血清中存在与其相识别的抗糖抗体,只是丰度存在差异。为进一步发展基于糖芯片技术的疾病诊断新方法奠定了基础。