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环境中的重金属镉(Cd2+)能够通过食物链进入人体,损害人类健康。对土壤中的重金属进行生物修复迫在眉睫。灰杨(Populus × canescens)对Cd2+具有超富集能力,在与真菌Paxillus involutus共生形成外生菌根后,能促进Cd2+在体内的积累。P.involutus的菌株MAJ和NAU能与灰杨形成兼容型和不兼容型两种不同的外生菌根(Ectomycorrhizae)。菌株MAJ侵染后,可以促进Cd2+在灰杨根部的积累,而菌株NAU能否影响宿主灰杨对Cd2+的吸收,还有待研究。研究显示,P.involutus侵染诱发宿主体内H2O2的产生,并激活宿主细胞质膜(PM)H+-ATPase活性。H2O2激活PM Ca2+通透性离子通道(CaPCs),促进Cd2+通过CaPCs的内流。此外,细胞外高浓度的Cd2+所形成的电化学势梯度也能够驱动Cd2+离子通过质膜上具有Cd2+透性的离子通道进入胞内。但Cd2+胁迫条件下,菌根中CaPCs是否介导Cd2+内流,及H2O2和PM H+-ATPase是否参与调控菌根对Cd2+的吸收过程,目前还不清楚。本文利用非损伤微测技术(NMT)测定了 Cd2+胁迫条件下菌根(MAJ、NAU)、非菌根(NM)灰杨及菌丝中Cd2+流、Ca2+流和H+流的动态变化。由于P.involutus侵染灰杨会诱发宿主产生H2O2并激活PM H+-ATPase,因此,本文重点研究H2O2和(PM)H+-ATPase调控CaPCs介导Cd2+内流的生理机制。为了确定菌根的Cd2+流究竟是源于真菌还是宿主细胞,本文测定P.involutus与灰杨共生7 d的根尖Cd2+流和Ca2+流的变化,以此确认成熟菌根的离子流模式与共生体形成初期的离子流向(主要是宿主细胞)是否一致。本文主要研究结果如下:1.瞬时(40 min)、短期(24 h)和长期(7 d)CdCl2(50 μM)处理条件下,菌根和非菌根灰杨均表现出明显的Cd2+内流,而且菌根的Cd2+流速更高。短期和长期Cd2+胁迫下,菌株MAJ和NAU也显现出相对稳定的Cd2+内流,并且内流强度随着CdCl2处理时间的延长(24 h→7 d)而增强。但两种菌株对于瞬时处理的反应具有明显差异:菌株MAJ对Cd2+的吸收明显高于菌株NAU。与之相似,瞬时Cd2+处理条件下的MAJ菌根也表现出比NAU菌根更强的Cd2+内流。在P.involutus与灰杨形成的外生菌根共生体中,Cd2+首先富集于外部的菌丝中,并向宿主转运。而不兼容型菌株NAU不同于兼容型菌株MAJ能与灰杨形成具有典型哈蒂氏网的功能性菌根,因此,相对于NAU菌根,外部菌丝富集的Cd2+更易进入菌株MAJ侵染后的宿主细胞。2.本文还测定了P.involutus侵染7d的灰杨根尖的Cd2+流和Ca2+流变化。短期Cd2+处理条件下,菌株MAJ和NAU侵染的灰杨根尖的Cd2+和Ca2+内流明显高于未侵染灰杨,表明P.in.involutus在侵染初期即可促进宿主对Cd2+的吸收。此外,对菌根、非菌根灰杨及菌株的Ca2+流和Cd2+流进行了相关性分析,结果显示,瞬时、短期和长期Cd2+处理条件下,菌根的Cd2+和Ca2+流都与未侵染根尖的离子流具有显著的相关性,而与菌株的相关性较低。由此表明,NMT微电极测得的菌根共生体持续的Ca2+流和Cd2+流主要是源于宿主根细胞,而不是外部菌丝。3.对菌根和灰杨根尖Ca2+流和Cd2+流进一步的相关性分析表明,Cd2+存在时的Ca2+流和Cd2+流之和(∑Ca2++Cd2+)与无Cd2+条件下的Ca2+流(∑Ca2+(-Cd2+))具有高度相关性。由于Ca2+离子主要是通过质膜Ca2+通道进入细胞,因此推断,Cd2+离子也是通过同样的途径进入菌根和灰杨根细胞:即Cd2+是通过质膜CaPCs进入菌丝和宿主细胞。P.involutus侵染和Cd2+处理均激活灰杨根细胞及菌丝中的CaPCs,促进菌根及菌丝对Cd2+的吸收。由于菌根和菌丝中激活的质膜CaPCs对Cd2+具有透性,因此Cd2+离子可以通过CaPCs进入植物根细胞。离子竞争性实验和药理学实验的结果证明了这一推论。在测试液中加入Ca2+显著影响菌根和灰杨根尖Cd2+的内流水平,而且随着Ca2+浓度的提高(Ca2+:Cd2+=1:2,1:1,2:1)Cd2+内流逐渐减弱。此外,菌根和灰杨根尖Ca2+和Cd2+内流可均被4种Ca2+离子通道抑制剂(LaCl3、GdCl3、verapamil及TEA)有效抑制。并且菌株MAJ和NAU中的Ca2+和Cd2+内流也同时被上述4种抑制剂所阻断,甚至将内流转变成外流。以上结果表明二价阳离子Cd2+和Ca2+可能竞争性地通过质膜Ca2+通透性离子通道,但并不排除灰杨和菌丝中其它离子通道或转运体所介导的Cd2+吸收(但所占比例较小)。4.P.involutus侵染和Cd2+胁迫都会诱导宿主体内H2O2的产生。H2O2电极的测试结果表明灰杨根尖显示稳定的H2O2外流,CdCl2处理(50 μM CdCl2,30 min)使H2O2流速增加2.4倍。菌株MAJ和NAU侵染能显著增加宿主灰杨根尖H2O2的外流,但CdCl2处理并未进一步增加菌根的H2O2外流,反而降低了 H2O2的流速。H2O2(1.0 mM)提高了菌根、灰杨根尖及菌丝中质膜CaPCs介导的Cd2+和Ca2+的内流。与此相反,ROS清除剂DMTU显著抑制菌根、灰杨根尖及菌丝中的Cd2+和Ca2+内流,但是,DMTU对NAU菌根离子流的抑制作用弱于MAJ菌根。以上结果表明,菌丝侵染和Cd2+诱导产生的H2O2促进了 Cd2+通过质膜CaPCs进入菌根共生体。因此,在非胁迫条件下,菌根共生体产生的H2O2促进了 Ca2+通过质膜CaPCs进入宿主细胞;而当环境中存在高浓度的Cd2+时,H2O2则促进Cd2+向菌根内部的流动。5.H+动态离子流的结果表明P.involutus侵染和Cd2+胁迫激活了宿主细胞和菌丝的PM H+-ATPase。P.involutus侵染灰杨后H+外流明显增加,但被PM H+-ATPase抑制剂原钒酸钠显著抑制,表明真菌侵染激活了菌根的PM H+-ATPase。活化的PM H+-ATPase将H+泵出细胞并维持跨质膜的电化学势梯度,促使质膜超极化。菌根、灰杨根尖及菌丝的Ca2+和Cd2+内流在酸性pH(5.2)时最强,表明CaPCs介导的离子内流受PM H+-ATPase调控。因此,灰杨根细胞PM H+-ATPase的激活一方面使宿主根际维持较适宜的酸性环境,促进Cd2+和Ca2+的跨膜内流;另一方面还为质膜提供适宜的H+电化学势梯度,维持质膜超极化,促进Cd2+通过超极化激活的质膜Ca2+离子通道(HACCs)的内流。研究发现,原钒酸钠对NAU菌根Cd2+流的抑制作用弱于MAJ菌根,与DMTU的效果相似。从两种菌根响应H2O2清除剂和PM H+-ATPase抑制剂的差异可以看出,Cd2+除了主要通过HACCs进入NAU菌根外,非电压依赖性Ca2+离子通道(VICCs)也可能参与介导Cd2+的内流。综上,本文提出了 P.involutus-灰杨菌根共生体调控Ca2+通透性离子通道介导Cd2+内流的富集机制。在非菌根灰杨中,Cd2+诱导灰杨根细胞产生H2O2并激活PM H+-ATPase,从而促进Ca2+通透性离子通道介导的Cd2+内流,CaPCs在无Cd2+存在时介导Ca2+内流,而在Cd2+存在时允许Cd2+内流。而在菌根共生体中,外部菌丝能够富集Cd2+并将其转运到宿主根细胞。再者,菌株MAJ和NAU侵染能诱导宿主体内产生大量H2O2,并进一步增强PM H+-ATPase活性,H2O2和质子泵促使CaPCs尤其是HACCs介导Cd2+内流。Cd2+通过质膜CaPCs进入宿主根细胞会竞争性地抑制Ca2+的吸收,造成Ca2+内流减弱,最终实现Cd2+在菌根中的富集。