目的宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，近年来，由于细胞学检查技术的开展，其发病率有所下降，并有许多患者在疾病早期即得以发现。随着社会生活的变化，近20年来发病率呈年轻化趋势。由于早期诊断率的提高和年轻患者的增加，对治疗后的生活质量有了进一步的要求。现在，保留功能的手术在肿瘤治疗中得到重视。但是，保留功能意味着手术切除范围的缩小，残留病灶的增加，转移和复发的机会随之增加。肿瘤转移是导致临床肿瘤患者死亡的主要原因。细胞在侵袭和转移过程中必须突破由细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)构成的屏障，而ECM的主要组成部分就是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)。乙酰肝素酶(Hpa)是迄今为止在哺乳动物中发现的唯一一种裂解HSPG中HS链的糖苷酸内切酶。Hpa不仅降解HSPG，破坏ECM的完整性，还可释放其结合的多种生长因子和细胞因子而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。因此，我们希望以Hpa基因的干扰作为突破点，通过对它的控制达到预防肿瘤侵袭，治疗肿瘤的目的。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。RNAi实验时，siRNA序列的筛选是实验成功的关键。本研究的第一部分检测了Hpa基因mRNA及蛋白在宫颈癌组织中的表达情况及其与肿瘤生物学行为的关系；第二部分通过体外合成的方法合成了4条siRNA序列，转染Hela细胞后筛选出有效序列；第三部分观察了抑制Hela细胞Hpa的表达后对细胞黏附、侵袭和转移功能的影响及相关蛋白的变化。实验材料和方法第一部分：采用免疫组化SABC法及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测46例宫颈癌、10例CIN、10例正常宫颈组织中Hpa基因mRNA及蛋白的表达情况及其与各种临床病理参数的关系。第二部分：采用体外合成的方法针对Hpa基因序列不同位点合成4条siRNA及非特异性siRNA序列，脂质体法瞬时转染宫颈癌Hela细胞，应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western-Blot鉴定上述序列对Hpa mRNA和蛋白的干扰效果，筛选有效序列。第三部分：脂质体法瞬时转染特异性干涉序列入Hela细胞后，细胞黏附试验检测细胞黏附能力的变化；Transwell侵袭小室测定法检测细胞体外侵袭力的变化；Millicell小室测定法检测细胞趋化运动能力的变化；Western-Blot检测血管形成相关因子——bFGF、VEGF蛋白表达的变化。以上结果使用SPSS11.0统计软件进行数据处理，以P＜0.05为有统计学意义。结果第一部分：应用免疫组化SABC法检测46例宫颈癌组织中Hpa蛋白的定位及表达情况，结果显示：在癌细胞的细胞膜和／或细胞质中出现棕黄色至棕褐色颗粒状物，在癌间质中可见部分血管内皮细胞、平滑肌细胞等呈阳性表达。在宫颈癌组织中的阳性表达率为69.6％，CIN组及正常宫颈组中为阴性表达。癌组织与CIN组及正常宫颈组比较差异有显著性(x~2=21.35，P=0.000)。Hpa蛋白表达与肿瘤临床分期和淋巴结转移密切相关(P＜0.01，P＜0.05)。Hpa mRNA的表达在宫颈癌组(73.9％)明显高于CIN组(20％)(x~2=9.63，P＜0.01)及正常宫颈组(20％)(x~2=9.63，P＜0.01)且其表达与宫颈癌临床分期、有无淋巴结转移密切相关(P＜0.01，P＜0.05)。第二部分：根据RNAi靶位点的筛选原则，选取4段序列，采用RT-PCR及Western-Blot鉴定靶位点RNAi的效果。结果显示，siRNA1#、siRNA4#均有抑制Hpa mRNA及蛋白表达的作用。siRNA1#对Hpa mRNA的干涉作用达64％，对Hpa蛋白的干涉作用达6296；siRNA4#对Hpa mRNA的干涉作用达67％，对Hpa蛋白的干涉作用达61％。采用不同浓度siRNA转染细胞，发现对Hpa mRNA及蛋白的干涉作用从24小时即开始出现，至72小时持续存在，各时间点间的Hpa mRNA及蛋白表达强度无显著性差异。检测转染后48小时的不同浓度siRNA1#组(20nmol／L、40nmol／L、100nmol／L)，差异有统计学意义(P＜0.05)，以100nmol／L组Hpa mRNA及Hpa蛋白减弱最明显。说明Hpa mRNA抑制靶基因的表达呈剂量依赖性。第三部分：特异性siRNA转染Hela细胞后细胞基质黏附能力与对照组及非特异性干扰组相比较显著降低(P＜0.01)；Transwell侵袭实验结果表明特异性干涉组侵袭至滤膜下层的细胞数明显低于非特异性干涉组和空白对照组(F=39.76，P＜0.01)，差异有统计学意义。细胞趋化运动实验表明特异性干涉组侵袭至滤膜下表面的细胞数显著低于空白对照组及非特异性干涉组(F=28.79，P＜0.01)。Western-Blot检测特异性干扰组Hela细胞中肿瘤血管生成相关基因bFGF、VEGF蛋白表达的变化，结果所示，特异性干涉组细胞中bFGF、VEGF蛋白表达明显减弱，与非特异性干涉组和空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.05)。结论第一部分：宫颈癌组织中肝素酶的表达增强，并且其表达与宫颈癌的进展及转移潜能有关，可能参与了宫颈癌的侵袭、转移。以肝素酶为靶点，通过对其抑制与干扰阻断其促进肿瘤侵袭和转移的作用，对其深入研究有可能为宫颈癌治疗提供新途径。第二部分：通过将体外合成的Hpa siRNA导入Hela细胞中，诱发了RNAi现象，筛选出Hpa siRNA1#和Hpa siRNA4#均能特异性地抑制Hpa基因mRNA及蛋白的表达，提示我们利用RNAi技术可以显著地抑制Hpa基因的表达，为研究Hpa在肿瘤侵袭、转移中的作用提供了有效方法，并有可能成为宫颈癌基因治疗的一个重要手段。第三部分：通过将体外合成的特异性siRNA转染入Hela细胞，发现Hpa siRNA不仅能显著抑制Hela细胞的黏附、侵袭和转移能力，还能够降低血管生成相关因子(bFGF、VEGF)的表达。