乙型肝炎病毒(Heptitis B virus,HBV)为嗜肝部分双链DNA病毒,慢性HBV感染者约有25%-40%可能死于肝硬化和肝癌,对不同预后患者的宿主遗传特征进行研究,是目前关注的重点之一。HBV引起的肝脏病理损伤非病毒直接破坏,而是与宿主细胞免疫反应密切相关。已有大量研究发现,肝脏炎症程度影响临床转归,而慢性HBV感染者的肝脏炎症程度除病毒因素之外,与宿主T细胞免疫功能密切相关。研究表明,T淋巴细胞功能受到免疫调节因子的调控。其中PD-1、Bim、IL-7Rα等调节蛋白对T淋巴细胞功能的调节是近年来研究的热点,它们在HBV感染慢性化中的作用已经比较明确。PD-1(Programmed death 1,PD-1)基因PDCD1位于人类基因组2q37.3,其基因表达蛋白PD-1是一类能够显著抑制T细胞活化和调节免疫应答的CD28/B7家族成员;研究认为PD-1过度表达是功能耗竭T细胞的特征,PD1/PD-L1通路可产生抑制信号,影响T细胞清除病毒功能。Bim(Bcl2-interacting mediator,Bim)基因Bcl2l11位于人类基因组2q13,是Bcl-2家族促凋亡因子之一;Bim过度表达能引起细胞色素C释放导致T细胞凋亡的发生。IL-7Rα(Interleukin-7 receptorα)基因CD127位于人类基因组5p14-p12,其基因表达对T淋巴细胞的成熟、维持及免疫发挥重要作用。已知慢性HBV感染者HBV特异性T细胞功能耗竭,上述免疫调节蛋白表达异常影响CD8+T细胞免疫功能。因此对免疫调节蛋白表达是否受其基因多态性影响值得深入研究。调控基因表达的方式多样,其中基因多态性是已知方式之一。人类基因组有多态性特质,形式包括单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism SNP)和拷贝数变异( Copy Number Variations CNV)。2006年全基因组CNV图谱,对四个不同组系的270个个体研究分析,发现了1447个富含CNVs区域,覆盖率占整个人类基因组的12%。这一研究结果表明CNVs是任意两个个体间SNP差异的5-10倍,并使两个个体间DNA序列的不同之处达到10%。随着对CNVs的深入研究,基于全基因组关联策略的遗传关联研究(Geneome-wide association study,GWAS),已发现包括感染性疾病在内的多种疾病的致病机制或易感性与CNVs有关。目前已有超过20000个CNVs区域及超过6000个CNV公布于基因组拷贝数数据库(Database of Genomic Variation);这些CNVs区域包括数百万的功能基因、多个致病基因座位及基因的功能调控性因子,它们影响基因的表达或直接造成个体对疾病的易感性、药物代谢及表型多样性。在感染性疾病领域,有研究表明,基因拷贝数变异可影响宿主对HIV及HCV的疾病易感性。基于上述背景,本研究将探讨慢性HBV感染不同转归者PDCD1、Bcl2l11、CD127等免疫调节基因拷贝数变异及其拷贝数变异对基因表达的影响,以及基因多态性在不同转归者之间是否存在分布规律。研究目的探讨慢性HBV感染不同转归者PDCD1、Bcl2l11、CD127等免疫调节基因拷贝数变异、拷贝数变异对基因转录水平和在外周血CD8+T细胞上蛋白表达水平的影响,以及基因多态性在不同转归者之间是否存在分布规律。研究方法与技术(1)收集不同慢性HBV感染临床转归患者及健康对照组共111例,包括慢性携带组33例(携带组),慢性乙型重型肝炎组19例(重肝组),乙肝相关性原发性肝癌组29例(肝癌组),健康对照组30例(对照组)。(2)获取Bcl2l11、CD127、PDCD1基因生物学信息。(3)构建单拷贝Bcl2l11、CD127、PDCD1基因标准品并测序。(4)构建单克隆Bcl2l11、CD127、PDCD1基因cDNA标准品并测序。(5)Applied Biosystem TaqMan Copy number Assays及TaqMan Copy number Refference Assays检测不同转归慢性HBV感染者Bcl2l11、CD127、PDCD1基因拷贝数;实际检测Bcl2l11基因109例、CD127基因105例、PDCD1基因106例。(6)Applied biosystem TaqMan Gene expression Assays检测不同转归慢性HBV感染者外周单个核细胞mRNA转录。(7)采用三色流式细胞术检测不同转归慢性HBV感染者外周CD8+T细胞IL-7 Rα、PD-1及胞内Bim蛋白表达水平。(8)统计学方法卡方检验分析各组间拷贝数分布差异,Kruskal-Wallis及秩变换分析检验四组实验对象各基因在外周单个核细胞mRNA表达水平,单因素方差分析检验四组实验对象各基因在CD8+T细胞蛋白表达水平,偏相关分析探讨基因拷贝数与其转录、蛋白水平关系。研究结果一、Bcl2l11、CD127、PDCD1基因拷贝数检测结果(1) Bcl2l11基因:该基因拷贝数变异范围为1～4拷贝。卡方检验分析比较各组人群拷贝数分布,发现组间总体分布差异有显著性。其中携带组以2拷贝为主,携带组人群2拷贝率明显高于重肝组(45.46% VS 21.05%)及对照组(45.46% VS 16.67%),差异有统计学意义。(2)CD127基因:宿主该基因拷贝数变异范围为1～6拷贝,经统计学分析,各组间CD127基因拷贝数分布差异无显著性。(3)PDCD1基因:宿主该基因拷贝数分布范围为0～3拷贝,其中单拷贝率在对照组、携带组、重肝组和肝癌组分别是37.0%、35.5%、26.3%和6.9%, 2拷贝率分别为55.5%、58.0%、63.1%和82.7%, 3拷贝率分别3.7%,6.4%,10.5%,10.3%,总体拷贝数分布差异各组间有显著性统计学意义(χ2=9.583,P=0.022)。与对照组相比,PD-1基因单拷贝率在携带组、重肝组和肝癌有逐渐下降、多拷贝率逐渐升高趋势。其中肝癌组与对照组拷贝数分布差异有显著性,其余二组间及与对照组间差异无显著性。二、Bcl2l11、CD127、PDCD1基因mRNA转录水平检测结果(1)各组Bcl2l11基因mRNA转录水平转录水平中位数分别为0.01(2对照组)、0.016(携带组)、0.007865(重肝组)、0.007859(肝癌组),Kruskal-Wallis检验提示各组实验对象表达水平存在差异(χ2=20.643,P=0.000<0.01)。携带组PBMC中Bcl2l11转录水平均高于重肝组及肝癌组(P<0.0083),但携带组与对照组相比,差异不显著。(2)各组CD127基因mRNA转录水平的中位数分别为0.194(对照组)、0.164(携带组)、0.083(重肝组)、0.058(肝癌组),Kruskal-Wallis检验提示各组表达水平差异有显著性(χ2 =27.608,P=0.000<0.01)。携带组和正常组CD127转录水平明显高于重肝组及肝癌组(P<0.0083)。(3)各组PDCD1基因mRNA转录水平中位数分别为0.00254(对照组)、0.00272(携带组)、0.00255(重肝组)、0.00133(肝癌组),Kruskal-Wallis检验提示各组实验对象表达水平存在差异(χ2=13.911,P=0.003<0.01)。肝癌组PDCD1基因mRNA表达水平明显低于其他三组(P=0.001<0.0083);携带组和重肝组与对照组相比差异不显著。三、外周CD8+T细胞Bim、IL-7Rα、PD-1蛋白表达水平检测。(1)各组Bim蛋白表达水平(平均荧光强度)分别为:199.6±33.80(对照组)、182.5±46.93(携带组)、384.6±96.00(重肝组)、352.8±110.16(肝癌组),四组间单因素方差分析结果示,各组间蛋白表达水平存在统计学差异(F=49.482,P=0.00),其中重肝组和肝癌组均高于对照组和携带组,差异有统计学意义。(2)各组IL-7Rα蛋白表达水平(平均荧光强度)分别为:50.6±19.06(对照组)、69.3±24.43(携带组)、42.8±13.94(重肝组)、59.5±15.25(肝癌组),四组间单因素方差分析结果示,各组间蛋白表达水平存在统计学差异(F=9.644,P=0.00);重肝组低于携带组和肝癌组,差异有统计学意义。(3)各组PD-1蛋白表达水平(率):3.72±0.32(对照组)、7.15±0.76(携带组)、13.40±3.68(重肝组)、16.13±1.68(肝癌组),四组间单因素方差分析结果示,各组间蛋白表达水平存在统计学差异(F=12.41,P=0.00),其中重肝组和肝癌组均高于对照组、携带组,差异有统计学意义。四、基因拷贝数与基因表达水平相关关系(1)在对照组、携带组、重肝组和肝癌组等四组人群中,PDCD1基因单拷贝率依次下降,多拷贝率逐渐增高,即在对照组和病毒携带者中该基因为单拷贝者居多,而重肝和肝癌组人群以多拷贝为主。多拷贝人群PD-1在外周血CD8+T细胞上的表达水平高于单拷贝者。(2)PDCD1基因mRNA转录水平与基因拷贝数似有负相关关系,但差异无显著性。(3)Bcl2l11基因拷贝数在对照组、携带组、重肝组和肝癌组等四组人群中总体存在拷贝数变异,其中携带组以2拷贝居多,其人群比例高于其他三组。伴随基因拷贝数增加(1至3拷贝),Bcl2l11转录水平有升高趋势,但与蛋白表达水平无明显相关性。(4)CD127在各组间基因拷贝数差异的分布无显著性。研究结论(1)PDCD1基因拷贝数在慢性HBV感染不同转归组间分布存在差异,重肝和肝癌患者基因拷贝数高于对照和携带人群。伴随拷贝数增加,PD-1的表达增加,提示PDCD1基因拷贝数变异可能是调节基因表达的方式之一,进而影响CD8+T细胞功能。(2)慢性病毒携带者Bcl2l11基因拷贝数以2拷贝为主,临床意义有待进一步研究。(3)各基因mRNA转录水平与其拷贝数之间没有观察到显著意义的相关关系,对基因转录水平的变化规律尚需更多研究。