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研究背景和目的:肥胖和2型糖尿病状态下的长期低水平炎症反应是心血管疾病发生的重要病理基础。近年来,关于人外周血免疫细胞亚群的研究发现了许多与炎症密切相关的细胞亚群,其中调节性T细胞(Regulatory T cells, Treg),高表达CD16的单核细胞,高表达CD146的T细胞等尤其受到关注。研究发现胰岛素具有显著的抗炎、抗氧化应激等作用,胰岛素是否可以通过对上述细胞进行调节而发挥其抗炎作用尚不明确。有前期研究发现胰岛素疗法可以增加外周血CD34+干/祖细胞数量,而胰岛素是否对CD34+细胞有直接动员作用尚待明确。另外,单核细胞-内皮细胞粘附是动脉粥样硬化发病的重要环节,而胰岛素对其调控作用目前尚无统一认识。因此,本研究拟探讨上述炎症细胞亚群在人群中的分布规律并探讨胰岛素静脉输注是否可以对上述细胞亚群水平进行调节,同时探讨胰岛素对人单核-内皮细胞粘附的影响。方法:第一部分:外周血炎症细胞亚群的流式细胞分析及优化探讨保存时间、红细胞裂解、固定/透膜液选择对流式细胞染色的影响及对TLR2和TLR4在不同细胞的表达进行初步观察,优化确定本课题的流式细胞染色方案,并对各细胞亚群在健康人群中的表达进行初步分析。第二部分:炎症细胞亚群在代谢综合征及2型糖尿病人群中的分布及增龄变化招募代谢综合征、2型糖尿病及健康受试者,通过流式细胞技术观察外周血Treg细胞、CD16+单核细胞、CD146+T细胞、CD34+干/祖细胞等水平,及单核细胞中TLR2、TLR4的表达。进行组间比较,并对一般资料、血清指标和流式细胞结果进行相关性分析。第三部分:胰岛素输注对人外周血炎症细胞亚群的影响给予非糖尿病肥胖受试者输注胰岛素(与葡萄糖同时输注以防止低血糖)14小时,分离0、4、8小时时间点的新鲜单个核细胞,行流式细胞染色观察,同时观察NF-κB核转位和血浆炎症分子水平。受试者间隔2周再次接受单纯葡萄糖或生理盐水输注作为对照。第四部分:胰岛素对单核-内皮细胞粘附的影响及机制探讨通过CFDA-SE标记法观察胰岛素和/或LPS对HAEC和THP-1细胞粘附的影响。通过共培养与流式细胞分选,real-time PCR,观察共培养的HAEC细胞ICAM-1、TNF-α和THP-1细胞TNF-α、SOCS-3的表达水平变化。结果:第一部分细胞即时染色并固定,4℃保存过夜可保证时间差对实验结果的影响最小,Ficoll分选单个核细胞后染色比全血染色及红细胞裂解的染色效果更为稳定。我们检测到的健康人外周血各炎症细胞亚群的水平与文献报道相符。第二部分CD146+T细胞在2型糖尿病组的水平显著高于其余两组。CD34+干/祖细胞在2型糖尿病组呈下降趋势,TLR2及TLR4在2型糖尿病组有上升趋势,但无统计学意义。Treg细胞和CD16+单核细胞在三组间无显著差异。CD34+细胞水平与年龄负相关, CD146+T细胞水平与年龄正相关。Treg水平与血糖负相关。CD16+/CD14+单核细胞水平与甘油三酯负相关。第三部分胰岛素输注可以上调Treg水平,下调炎症性单核细胞水平,抑制外周血单个核细胞NF-κB的胞核转位和血浆MMP-9、MCP-1表达。但胰岛素输注对于CD146+T细胞水平并未产生显著影响。胰岛素输注在8小时内未对CD34+干/祖细胞水平产生影响。TLR2及TLR4未产生显著改变。第四部分LPS干预4小时可以促进THP-1细胞与HAEC的粘附,而胰岛素可以剂量依赖性地显著抑制LPS对THP-1/HAEC粘附的刺激作用。胰岛素体外干预4小时下调HAEC的ICAM-1及TNF-α表达,下调THP-1细胞的TNF-α及SOCS-3表达并抑制LPS的上调作用。结论:1.对于不同时间点人外周血标本的流式细胞比较研究,采用即时分离单个核细胞染色并固定的方法,可以更好地减少混杂因素干扰。2.人外周血各炎症细胞亚群在代谢综合征和2型糖尿病状态下及随着年龄增加发生一系列变化,表现为CD146+T细胞在2型糖尿病状态下上调及随年龄增加而上调,Treg水平随血糖升高而下降,CD34+干/祖细胞水平随年龄增加而下调,提示代谢综合征、2型糖尿病及高龄时的高炎症状态及体内抗炎、修复能力的增龄性下降。3.胰岛素输注可以上调人外周血的Treg水平并下调炎症性单核细胞水平,提示胰岛素的抗炎作用新机制。同时胰岛素输注对人外周血单个核细胞NF-κB核转位和MMP-9、MCP-1表达的抑制作用再次得到证实。4.胰岛素可抑制单核-内皮细胞的粘附,并抑制ICAM-1的表达;胰岛素显著下调TNF-α及SOCS-3表达,提示其可能对胰岛素抵抗具有改善作用。