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黄瓜枯萎病(Cucumber Fusarium Wilt)是黄瓜生产上严重的土传真菌病害。这种土传真菌能够在各种不同类型的土壤中存活并导致植株发病,病害一旦发生,往往会给黄瓜的质量与产量造成严重的损失。黄瓜枯萎病菌是尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)。关于尖孢镰刀菌的致病机理方面已有很多报道,主要包括导管堵塞假说、毒素作用假说、细胞壁降解等。但是由于对病原菌生物学特性认知的局限性,目前的研究还没有完全阐明黄瓜枯萎病菌的致病机理,因此对黄瓜枯萎病的防治仍然没有非常行之有效的措施。生物膜(biofilm)是微生物聚集在一起,附着在生物或者非生物的表面,并包埋在自身分泌的胞外物质里,与浮游状态相对的一种存在形式。生物膜的形成是人体、动物病原菌致病的关键因素。受人体角膜炎病原菌(Fusarium oxysporum)能够形成生物膜并参与致病的启发,本研究探索黄瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cucumerinum)Foc-GD生物膜的形成与致病性的关系。主要开展生物膜形成条件的摸索、生物膜特性的分析、生物膜调控基因的挖掘及功能验证等方面的研究。主要取得以下结果：1、黄瓜枯萎病菌Foc-GD生物膜的形成方法及条件。研究发现,用RPMI 1640培养基重悬黄瓜枯萎病菌Foc-GD孢子至106cfu/mL,将200μL标准的孢子悬浮液添加至平底96孔聚苯乙烯细胞培养板的每孔内,将细胞培养板置于28℃C培养箱内静置培养2h,用微量洗涤器将培养基及没有黏附到培养板的孢子轻轻吸取,用PBS轻柔地漂洗两次,最后粘附在细胞培养板表面的是生物膜的初始菌落,然后添加200μL RPMI 1640培养基于细胞培养板每个孔内继续静置培养48h,至生物膜成熟。采用XTT(3,3’-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠)减低法对生物膜进行半定量测定。结果显示,黄瓜枯萎病菌生物膜形成与培养基pH值、碳源和培养温度有关。生物膜形成最适温度是28℃,最适pH环境为微酸和中性环境(pH5-7),葡萄糖为碳源的培养基中能够形成生物膜。2、病原菌Foc-GD生物膜特性分析。黄瓜枯萎病菌形成的生物膜用荧光染料染色后,借助激光共聚焦显微镜观察生物膜微观结构。研究发现Foc-GD形成的成熟生物膜由浓密的菌丝细胞和胞外多糖分泌物组成,菌丝细胞与胞外多糖物质紧密排列,形成质地均一的复合体。成熟生物膜与浮游孢子相比,表现出对外界环境压力不敏感型。研究发现,在45℃的亚致死温度下,处理30 min和min,成熟生物膜的代谢活动无明显影响,而浮游孢子代谢活动分别降低了62.25%和86.29%。成熟生物膜与浮游孢子在-20℃,-10℃,4℃下处理24h,浮游孢子与成熟生物膜在4℃下代谢活动没有明显差异,而-20℃,-10℃的低温对成熟生物膜的影响明显小于对浮游孢子的影响。样品在紫外线下处理20min,30min后,成熟生物膜分别下降了29.18%、43.11%,而浮游孢子却下降了52.29%、90.23%。用6.4μg/mL的多菌灵、咪酰胺、丙环唑分别处理样品24h之后,成熟生物膜的代谢活动分别下降了33.8%、39.2%和26.6%,而浮游孢子分别下降了76.5%、73.2%、50.7%。3、病原菌Foc-GD丝绒蛋白基因FocVell的克隆与表达。研究表明,丝绒蛋白FocVell(GenBank:KJ716229)编码532个氨基酸,最大开放阅读框为1596bp,含有1个94bp的内含子。将FocVell氨基酸序列比对,分别与F.fujikuroi的FjVell (GenBank: FN548142), F. verticillioides的FvVel (GenBank:DQ274059), F. graminearum的FgVEA from (GenBank:JN635273)具有97.56%,97.74%,78.29%的相似性。借助实时荧光定量PCR分析FocVell在野生型Foc-GD菌丝发育的24,36,48,60,72h表达情况。FocVell在菌丝发育的24和36h,表达量较低(p<0.05)；在48h,达到高峰,在60和72h,表达量相对降低并稳定保持较高水平(p<0.05)。FocVell的表达结果与文献报道黄瓜枯萎病菌分生孢子梗在48h之后增殖的结果是一致的。4、黄瓜枯萎病原菌丝绒蛋白基因FocVell的功能验证。利用基因敲除与回补的方法研究FocVell的功能。研究发现,丝绒蛋白FocVell基因具有调控病原菌孢子发育、菌丝生长、细胞壁组分、生物膜形成与致病性的作用。用马铃薯葡萄糖(PDA)培养基培养菌株,FocVell敲除突变体△FocVell-3产孢量远远小于野生型菌株Foc-GD和回补突变体△FocVell-3C(p< 0.05),△FocVell-3菌落生长明显变慢,气生菌丝变少变短,并且菌丝分支明显增多。分别用1.0 M KCl、1.0 M山梨醇、16 μg/mL异菌脲、0.2 μg/mL咪鲜胺、48μg/mL恶霉灵、0.05%刚果红、5mM咖啡碱添加至培养基,研究菌落对渗透压力与细胞破坏剂的敏感性。研究发现,△Foc Vell-3对1.0 M KCl、1.0 M山梨醇、0.05%刚果红、5 mM咖啡碱的敏感性下降(p<0.05),对16 μg/mL异菌脲、0.2 μg/mL咪鲜胺的敏感性上升(p<0.05),结果表明Focvell可能与细胞壁的组成、细胞壁的完整性有关。生物膜形成比较发现,在聚苯乙烯片上,突变体△FocVell-3孢子在聚苯乙烯板上的聚集减少,而且孢子萌发和菌丝的生长延迟,△FocVell-3形成的生物膜比较稀薄,比较松散,菌丝与胞外物质分布不均。XTT半定量法测定显示野生型Foc-GD和回补型菌株△FocVell-3C成膜的量分别是基因敲除突变菌株△FocVell-3的1.23,1.52,1.69,2.56倍。用突变体△FocVell-3与野生型Foc-GD、回补型△FocVell-3C接种黄瓜苗,15天后,接种野生型Foc-GD和回补型△FocVell-3C的黄瓜苗逐渐发病并枯萎死亡,病情指数DSI分别为93.7和92.3,而接种FocVell基因敲除突变菌株△FocVell-3的黄瓜苗发病率明显下降,多数黄瓜苗只出现轻微黄化症状,病情指数DSI为37.3(p<0.05)。结果表明FocVell基因与黄瓜枯萎病菌F. oxysporum f. sp. cucumerinum生物膜形成及致病力有关。5、黄瓜枯萎病菌转化GFP载体。借助激光共聚焦显微镜观察到在接种病原菌孢子悬浮液24h后,孢子不断萌发并粘附到黄瓜苗侧根的表面,随着接种时间的延长,病原菌逐渐刺穿侧根表皮,进入表皮细胞。侵染进展期,病原菌侵入主根表皮,并不断向维管束部分侵染,接种120h之后,即侵染后期,病原菌占据主根维管束部位,菌丝逐渐密集成交错菌丝网。本研究中黄瓜枯萎病菌Foc-GD FocVell基因敲除后,生物膜的形成受损,致病力下降,表明生物膜的形成是植物病原真菌重要的致病因子,该研究结果为揭示黄瓜枯萎病的致病机理提供新思路,对黄瓜枯萎病的综合防控提供理论支持。