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目的细胞膜转运,即细胞膜及膜上蛋白(包括EGFR等表面受体)在一定条件下的内转到早期内涵体后,或经循环通路回到胞膜表面,或经溶酶体降解,或定位到另一细胞器。它对细胞的增殖、分化、极化、迁移和凋亡等多种细胞功能具有关键性的作用,对肿瘤的发生发展有重要作用。EHD2蛋白一类新型膜转运调控蛋白,是EHD家族(包括EHD1、EHD2、EHD3、EHD4)成员之一,它可以参与胞膜转运的各步调控,包括内转及前、后内含体的过渡,还具有调控循环通路的功能,从而调控各种膜蛋白胞内信号转导。本课题通过构建EHD2干扰质粒,经慢病毒体系对HeLa细胞进行感染抑制EHD2蛋白表达,利用免疫荧光,流式细胞术等方法,观察其对EGFR内吞转运的影响。方法1.利用已构建pGCSIL-Amp/puromycin质粒载体,经慢病毒体系对宫颈癌细胞HeLa进行感染抑制EHD2蛋白表达。2.利用有限稀释法获得HeLa细胞的若干克隆,并经慢病毒体系对各克隆进行EHD2降表达,并用Western Blot检测EHD2蛋白表达情况。3.利用多肽亲和层析法纯化EHD2的兔多克隆抗体。4.EGF刺激HeLa细胞,利用共聚焦显微镜观察EHD2与EGFR的共定位。5.在EHD2降表达的条件下,用EGF刺激细胞,然后用免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察EHD2对EGFR转运的影响,同时共同染色受体转运各步骤中的已知标记蛋白如Rab5(标记早期内涵体)、EEA1(标记早期内涵体)、LAMP 1(标记溶酶体)等。6.在类似以上的条件下,用Fluorescence Activated Cell Sorting(FACS)法分析细胞表面EGFR的表达及内吞状况,从而定量分析EHD2对EGFR的转运调节作用。结果1.EHD2在宫颈癌细胞HeLa表达较高,利用有限稀释法得到单克隆,命名为HeLaMl,M2…,各克隆EHD2表达水平无明显差别。2.将纯化最有效的干扰质粒siEHD2-46,经慢病毒体系对HeLa细胞系及各单克隆进行感染,分别利用有限稀释法筛选得到EHD2降表达的有效克隆,命名如 HeLaM2O-LsiEUD2-46。3.EHD2抗体的纯化,并检验确认了其在免疫荧光中的应用和特异性。4.EGF刺激后EGFR和EHD2共定位于胞内囊泡结构。5.EGF刺激后,EHD2干扰加速EGFR的内吞。6.EGF刺激后,EHD2干扰加速EGFR的降解。结论EHD2小RNA干扰后,EGF刺激下促进了 HeLa细胞EGFR的内吞及降解,表明EHD2负调控EGFR内吞并减少随后的降解。