目的:溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种非特异性的炎症性肠病,病因和发病机制尚未完全阐明,治疗效果不够理想,是临床常见的难治病。中医药防治本病有悠久的历史和丰富的经验,值得我们总结和研究。尽管中医药在治疗UC的免疫功能紊乱和炎症反应方面做了大量的临床和实验研究,但治疗方法仍为各家经验之谈,缺乏疗法的对比研究。中医药治疗UC的优势在于降低复发率及远期疗效的提高,根据中医理论,综观慢性UC(缓解期)临床治疗的有关方药,其治法基本属于益气、活血、健脾、补肾范畴。因此,我们拟建立DSS诱导的小鼠UC模型,从细胞因子角度、mRNA转录及蛋白质翻译水平,进行益气活血健脾补肾法(代表方分别为保元汤、桃红四物汤、参苓白术散、金匮肾气丸)对实验性小鼠结肠炎防治作用及机制的比较研究,特别是对慢性炎症疗效的机制探讨,为发挥中医药防治UC的优势提供实验依据,具有重要的理论及临床意义。 方法:(一)益气活血健脾补肾法对UC小鼠的防治作用及机制探讨:BALB/C小鼠100只,体重20±2g,雌性,随机分为7组,分别为正常对照组、模型组、SASP对照组、益气法组、活血法组、健脾法组及补肾法组,正常对照组10只,其他各组15只。药物组(SASP对照组、益气法组、活血法组、健脾法组及补肾法组)预先给药,每天1次,共3天。第4天起除正常对照组外,其他各组(模型组、SASP对照组、益气法组、活血法组、健脾法组及补肾法组)小鼠自由饮用3%DSS液7天,其中药物组(SASP对照组、益气法组、活血法组、健脾法组及补肾法组)继续给药,每天1次;同时观察各组小鼠的一般情况及称重,对各组(除正常对照组)小鼠进行DAI评分。第11天取小鼠血清、脾脏及结肠组织,分别进行处理:(1)小鼠眼球法取血,静置待凝,2500r/min离心15min,取血清-70℃冰箱冻存待测IFN-γ、IL-4及IL-10(ELISA法)(2)分别取小鼠脾组织及有严重炎症或溃疡结肠组织约200mg剪碎,加入生理盐水,用玻璃匀浆器制成20%匀桨,然后以5000r/min离心15min,取上清液,置-70℃冰箱冻存待测IFN-γ、IL-4及IL-10。(3)取小鼠肛门至回盲部的结肠,沿肠系膜纵向剖开,在近回盲部另取结肠(2mm×10mm),4%多聚甲醛固定,石腊包埋,切片HE染色评估组织学损伤,免疫组织化学法观察TNF-α、iNOS的表达。(二)益气活血健湖北中医学院博士学位论文 脾补肾法对慢性UC小鼠的治疗作用及机制探讨:BALB/C小鼠100只,体重20士 29,雌性,随机分为7组,分别为正常对照组、模型组、SASP对照组、益气法 组、活血法组、健脾法组及补肾法组;正常对照组10只,其他各组巧只。除正 常对照组外,各组小鼠自由饮用3%DSS液7天,第8天起自由饮用蒸馏水14天。第22天起药物组(SASP对照组、益气法组、活血法组、健脾法组及补肾组)分别给药,每天1次,共7天,观察小鼠一般情况及称重,进行DAI评分。第29天处死各组小鼠取结肠(2二x1OJnm),4%多聚甲醛(含DEPC)固定、石腊包埋、切片HE染色评估组织学损伤,用免疫组织化学、原位分子杂交方法观察NF一‘BP65、TGF一p、COX一2、EGF及其mRNA的表达。 结果:(一)益气活血健脾补肾法对UC小鼠的防治作用及机制探讨:(1)模型组DA工评分(第4、5、6、7天)、组织学损伤积分(炎症、病变深度、隐窝破坏)均明显高于正常对照组;SASP组、活血组、健脾组及补肾组DAI评分(第6、7天)、组织学损伤积分(炎症、病变深度、隐窝破坏)均低于模型组(均为P<0 .05)。(2)模型组结肠组织TNF一a、iNOS的表达高于正常对照组;SASP组、活血组、健脾组及补肾组结肠组织TNF一a、iNOS的表达低于模型组(均为P<0 .05)。(3)模型组结肠组织工FN一Y含量较正常对照组高,健脾组、补肾组结肠组织工FN一Y含量低于模型组;模型组结肠组织IL一10含量较正常对照组低,活血组、健脾组及补肾组结肠组织IL一10高于模型组(均为P<0 .05)。(二)益气活血健脾补肾法对慢性UC小鼠的治疗作用及机制探讨:(1)模型组组织学损伤积分(炎症、病变深度、隐窝破坏)均明显高于正常对照组;SASP组、活血组及补肾组组织学损伤积分均低于模型组(均为P<0.05)。(2)模型组结肠组织NF一K BP65及其mRNA的表达(染色积分、平均光密度、平均灰度)均明显高于正常对照组,SASP组结肠组织NF一K BP65的表达(染色积分)低于模型组,活血组、健脾组及补肾组结肠组织NF一K BP65及其mRNA的表达(染色积分、平均光密度、平均灰度)低于模型组(均为P<O,05)。(3)模型组结肠组织COX一2及其mRNA的表达(染色积分、平均光密度、平均灰度)均明显高于正常对照组,SASP组、活血组、健脾组及补肾组结肠组织cox一2及其mRNA的表达(染色积分、平均光密度、平均灰度)低于模型组(均为尸<0 .05)。(4)模型组结肠组织TGF一pl及其mRNA的表达(染色积分、平均光密度、平均灰度)均明显高于正常对照组,活血及补肾组结肠组湖北中医学院博士学位论文织TGF一pl及其mRNA的表达(染色积分、平均光密度、平均灰度)低于模型组(均为P<0.05)。(5)益气组及健脾组结肠组织EGF及其mRNA的表达(染色积分、平均光密度、平均灰度)均高于模型组(均为p<0 .05)。 结论:(1)模型组DAI评分(第4、5、6、7天)、组织学损伤积分(炎症、病变深度、隐窝破坏)均明显高于正常