气管上皮在正常情况下更新缓慢，但在损伤修复时能再生以维持其完整性，这种修复能力证明气管上皮中存在干细胞，只有在损伤的过程中才能激活其潜能。前期研究发现，正常气管上皮细胞不表达胚胎干细胞相关基因Oct3/4、Sox2、Nanog，而在5-Fu作用后，气管上皮基底膜上仅残留少量的细胞，这些细胞Oct3/4、Sox2、Nanog出现阳性表达，而且阳性细胞一度增生，当出现纤毛细胞、粘液细胞、基底细胞分化后，这些胚胎干细胞标记物的表达逐渐下调消失。5-Fu诱发气管上皮损伤修复过程中Oct3/4、Sox2、Nanog出现有规律消长，本文从组蛋白修饰、染色质重塑方面解析上述现象的分子调控机制。　　 依据肿瘤干细胞理论推断，肺癌可能是一种干细胞疾病:具有自我更新和无限增殖能力的肺癌干细胞是肺癌发生的根源;肺癌的复发、侵袭转移、耐药、抗辐射等恶性表型特征都与肺癌干细胞有关。现行抗癌药物几乎都是针对增殖期癌细胞，对静止期癌干细胞有耐药性，因此阐明癌干细胞的生物学特征，实现对细胞调控技术开发，尤为重要。　　 有关肺癌干细胞尚有争论，有人认为肺癌干细胞属于CD133+细胞，但最近有学者提出，应用免疫磁珠从A549和H446肺癌细胞系中分离出CD133+细胞和CD133-细胞，二者均具备相似的自我更新、侵袭及耐受化疗药物能力。最近从肺癌标本及肺癌细胞系中分离出了CD133+肺癌细胞(LC-CD133+)和CD133-肺癌细胞(LC-CD133-)，并发现高表达Oct3/4基因的LC-CD133+有明显自我更新能力和无限增殖潜能，体内外放化疗实验均表明，LC-CD133+对放化疗抵御能力与Oct3/4基因表达有关，Oct3/4是参与调控胚胎干细胞自我更新和维持其全能性的最为重要的转录因子之一，同时也是体外建立诱导多功能干细胞的关键基因。前期研究发现5-Fu诱发气管上皮损伤修复过程中Oct3/4、Sox2、Nanog出现有规律消长，提出Oct3/4、Sox2、Nanog可作气管上皮干细胞标记，但是肺癌细胞与肺癌干细胞的组蛋白修饰染色质重塑尚无报告。我们用5-Fu作用肺癌细胞引起Oct3/4阳性的肺癌细胞增加，通过荧光免疫双染等方法，比较此种细胞与普通肺癌细胞不同，本文从组蛋白修饰、染色质重塑方面解析上述现象的分子调控机制。　　 材料和方法：　　 一、离体大鼠气管损伤修复模型及肺腺癌Oct3/4阳性细胞的制备　　 取约200克左右的Wistar大鼠，雌雄不限，水合氯醛麻醉，无菌条件下取气管，PBS冲洗，置于DMEM/F12培养液中（含10％胎牛血清）。取正常气管剪取-气管环固定，留做石蜡切片，灌入蛋白酶Ⅳ(0.5mg/ml)，结扎另一端4℃消化过夜，收集消化液，加FBS至终浓度为2.5％终止酶反应收集正常气管皮细胞于2mlEppendorf管中，-70℃冻存，留做mRNA和蛋白提取。其余气管组织分5-Fu作用组。5-Fu作用组为5-Fu作用12小时后，置DMEM/F12培养液中（含10％胎牛血清），分别于换液后0、3、6、12、24小时取出气管组织分别固定，留做石蜡切片，其余消化，收集细胞于2mlEppendorf管中，-70℃冻存，留做mRNA及蛋白提取。人肺腺癌细胞株SP-A1细胞购自中国科学院上海细胞库，由本实验室培养传代，实验中所用为生长状况良好的细胞。细胞培养液为含10％胎牛血清的1640培养液，培养条件为37℃、含5％ CO2的细胞培养箱内。　　 本课题组已经通过MTT比色法实验，得到5-Fu最佳作用浓度为3μl/m l，作用时间为24个小时。肺腺癌细胞按5×105/mL密度接种于100ml培养瓶中，培养的肺腺癌细胞分为两组，一组是没有药物作用的肺腺癌细胞;另一组是经过5-Fu作用后的肺腺癌细胞。　　 二、免疫荧光单染　　 免疫荧光单染-抗为山羊抗Oct3/4、Sox2、PML、HP1α、H3K4Me2、H3K9ace、H3K9Me3、H3K27Me3，二抗分别TRITC标记兔抗羊IgG和FITC标记山羊抗兔IgG。DAPI复染细胞核。50％缓冲甘油封片，荧光显微镜OlympasBX51下观察并照相。以呈现红色或绿色强荧光信号（呈颗粒或线状者）定为阳性，阴性对照实验:用等量的0.01mol/LPBS代替一抗，其余步骤同前。　　 三、免疫荧光双染　　 免疫荧光双染用Oct3/4作为-抗，PML、HP1α、H3K4Me2、H3K9ace、H3K9Me3和H3K27Me3作为第二个一抗，二抗（TRITC标记兔抗山羊、FITC标记山羊抗兔、）用DAPI(10μg/ml)复染细胞核。荧光显微镜OlympasBX51下观察并照相。以呈现红色或绿色强荧光信号（呈颗粒或线状者）定为阳性。对照实验:用等量的0.01mol/L PBS代替一抗，其余步骤同前。　　 四、蛋白印迹检测　　 按蛋白抽提试剂盒说明抽提气管上皮细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳，50V恒压湿转120mins，BSA室温封闭2hrs，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育2hrs，DAB显色。转膜后各步之间均用洗膜液洗膜3次，每次5mins。相同条件下用β-actin作为内对照。　　 五、RT-PCR检测v按TrizolTM试剂使用说明提取气管上皮细胞总RNA，检测它的浓度，纯度和完整性。按逆转录试剂盒使用说明操作，选用Oligo-dT做引物合成第一链cDNA，逆转录条件为:30℃10min，40℃40min，99℃5min，5℃5min; PCR反应条件为:94℃变性2min后，94℃30s，退火，72℃1min，进行30个循环，最后于72℃延伸7min。所用引物序列见附表。扩增产物使用2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色分析表达结果，测灰度值，统计。相同条件下用β-actin作为内对照。　　 结果：　　 一、5-Fu诱导气管上皮损伤修复过程中气管上皮的变化　　 HE染色显示，离体气管在5-Fu的作用下，增殖期细胞脱落，基底膜上残余裸核样G0期细胞，散在分布;去除5-Fu作用3h后，细胞呈扁平状、胞浆拉长，试图覆盖基底膜;6h后，扁平状细胞增多;12h后，细胞变为立方状;24h后，细胞进一步增多，接近双层;至48-72h时，细胞变为复层，可见纤毛结构，基本恢复了气管上皮的正常结构。　　 二、5-Fu诱导气管上皮损伤修复过程中Oct3/4、sox2的表达变化　　 正常气管上皮几乎没有Oct3/4、sox2表达，去除5-Fu作用后0h，少量Oct3/4、sox2表达，随后表达量逐渐增高，至6h达到峰值，随后逐渐降低，至24小时几乎恢复至正常水平。　　 三、5-Fu诱导气管上皮损伤修复过程中PML、HP1α、H3K4Me2、H3K9Ace、H3K9Me3和H3K27Me3的表达变化　　 正常气管上皮几乎没有PML、HP1α、H3K4Me2、H3K9Ace的表达，去除5-Fu作用后0h，PML、HP1α、H3K4Me2、H3K9Ace少量表达，随后表达量逐渐增高，至6h达到峰值，随后逐渐降低，至48小时几乎恢复至正常水平;正常气管上皮H3K9Me3和H3K27Me3高表达，去除5-Fu作用后0h，H3K9Me3和H3K27Me3几乎不表达，之后表达逐渐增加，至24h几乎恢复正常水平。　　 四、5-Fu诱导气管上皮损伤修复过程中Oct3/4-PML双染的表达　　 正常气管上皮几乎没有Oct3/4、PML表达，去除5-Fu作用后0h，少量Oct3/4与PML同时表达，并表达在同一个细胞上。随后表达量逐渐增高，至6h达到峰值，随后逐渐降低，至24小时几乎恢复至正常水平。　　 五、人肺腺癌细胞在5-Fu作用下Oct3/4(+)细胞表达增多　　 肺腺癌细胞在5-Fu作用下Oct3/4(+)细胞表达增多。蛋白印迹检测，5-Fu作用后的肺癌细胞Oct3/4蛋白表达量增加;RT-PCR检测5-Fu作用后的肺癌细胞Oct3/4mRNA表达量增加。　　 六、转录活性标记物H3K4Me2和H3K9ace在Oct3/4(+)肺腺癌细胞的高表达，使常染色质处于转录活性状态　　 在Oct3/4(+)肺腺癌细胞核内，H3K4Me2和H3K9ace表达均增强。而在Oct3/4（-）肺腺癌细胞核内表达水平降低，说明肺腺癌细胞在5-Fu作用下组蛋白H3赖氨酸4位点发生了甲基化，组蛋白H3赖氨酸9位点发生了乙酰化，常染色质结构发生改变，处于转录活性状态。　　 七、异染色质标记物H3K9Me3和H3K27Me3在Oct3/4(+)肺腺癌细胞内的表达　　 在Oct3/4(+)肺腺癌细胞细胞核内， H3K9Me3和H3K27Me3表达减弱。在Oct3/4(-)肺腺癌细胞核内，H3K9Me3表达增强并发生凝聚;H3K27Me3表达增强并主要在核周。说明肺腺癌细胞在5-Fu作用下，组蛋白H3K9和H3K27发生了去甲基化。HP1α在Oct3/4(+)肺腺癌细胞内表达增强，而在Oct3/4(-)肺腺癌细胞核内表达减弱，蛋白印迹和RT-PCR检测与免疫荧光双染结果一致。　　 八、Oct3/4(+)肺腺癌细胞PML小体在核中参与转录，而且与一些基因富集的常染色质区域相关联　　 Oct3/4(+)肺腺癌细胞细胞核内，PML小体数量增多（每核15-20）;Oct3/4(-)肺腺癌细胞核内，PML小体数量减少(2-5)。Western blot分析表示PML蛋白质在5-Fu作用后的肺腺癌细胞内表达增加。RT-PCR结果，在5-Fu作用后的肺腺癌细胞PML-mRNA表达增加。　　 结论：　　 1、组蛋白修饰和染色质重塑支持Oct3/4阳性细胞为气管干细胞以及Oct3/4阳性癌细胞为癌干细胞;　　 2、组蛋白修饰和染色质重塑调控气管上皮细胞重编程及气管干细胞分化过程;　　 3、组蛋白修饰和染色质重塑为鉴别干细胞特性、癌干细胞的分离、鉴定和新的防治方法提供新依据。