全世界范围内现已有一亿七千万糖尿病患者，预计到2010年，患病人数仍将增长50％，其中2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)患者占总患病人数的90％左右，成为最为普遍的类型。由2型糖尿病引发的糖尿病肾病目前己成为西方国家终末期肾病最主要的原因，并随着发病范围的扩大，也将成为许多发展中国家最为常见的终末期肾病原因，给世界各国带来巨大的社会经济和医疗负担。 2型糖尿病表现为微量白蛋白尿和后继发生的明显的蛋白尿。已知肾小球内皮细胞和系膜细胞在糖尿病肾病的发生起一定作用，近来的研究显示肾小球足细胞在糖尿病肾病的早期阶段就出现了结构的改变，在肾活检组织和培养的足细胞中均观察到了nephrin的表达下降。 有关糖尿病肾病的发病机理研究，近来关于氧化应激的作用备受关注，线粒体产生的活性氧簇增多被认为在引起糖尿病的并发症中起重要作用。活性氧簇可在体内外氧化多种复合物，低密度脂蛋白因含有有较高量的多聚不饱和脂肪酸而较易为氧化。氧化型低密度脂蛋白与动脉粥样硬化的进展密切相关，多数引起动脉粥样硬化的因素也出现于肾小球内，因此氧化型低密度脂蛋白在糖尿病肾病中可能起相似的作用。 活性氧簇的水平取决于其产生的量和机体抗氧化物质的活性。过表达人的胞浆铜-锌超氧化物歧化酶转基因并诱发糖尿病的小鼠，其糖尿病的损伤程度显著改善，这表明超氧化物歧化酶有抗糖尿病肾病中的氧化损伤作用。因此研究糖尿病肾病中的脂质氧化损伤和抗氧化能力的改变无疑具有重要意义。 本研究旨在观察2型糖尿病肾病肾活检组织内的脂质氧化物和抗氧化物的表达情况，足细胞的损伤情况，脂质氧化损伤、抗氧化能力与肾功能、足细胞的变化以及其它临床病理资料间的相关性，同时通过体外实验来观察氧化型低密度脂蛋白对足细胞的损伤作用及机制。通过这些研究探讨2型糖尿病肾病的发病机制，为今后新的临床治疗策略提供重要理论基础。在这领域经国内外文献检索尚无系统深入的报道，因此本研究具有一定的创新性。 第一章2型糖尿病肾病中肾小球的脂质氧化损伤和足细胞的改变 目的：观察2型糖尿病肾病肾组织内的脂质氧化和抗氧化现象、足细胞蛋白表达的改变，并与临床病理资料进行相关分析，探讨脂质氧化损伤在2型糖尿病肾病发病机制中的作用和意义。 方法：收集100肾活检冰冻组织，其中20例原发性IgA肾病，20例原发性膜性肾病、20例原发性局灶节段性肾小球硬化，35例2型糖尿病肾病，所有病理诊断结果经免疫荧光、光镜和电镜检查后确定。5例正常肾组织经大体和病理检查均证实无肿瘤组织浸润。其中入选的35例2型DN均为根据Mazzucco等分类方法中的1型——糖尿病肾小球硬化型。 间接免疫荧光法观察各组织中铜氧化修饰的低密度脂蛋白(Cu2+-ox-LDL)和超氧化物歧化酶-1(SOD-1)表达情况，35例DN肾组织进行了Nephrin、Synaptopodin、ZO-1表达的检测，由于DN活检组织来源有限，其中10例DN肾组织和其它病理类型的肾组织和正常肾组织进行了丙二醛(MDA)、4-羟基壬烯醛(4-HNE)、血红素加氧合酶-1(HSP32)、热休克蛋白60(HSP60)的表达情况。 结果：所有正常肾组织中，除SOD-1在肾小球内可见有较弱的表达外，肾小球内脂质氧化物、其余抗氧化物全部阴性。原发性肾小球肾炎的肾组织中，2例IgA肾病、2例MN肾小球内分别有少量Cu2+-ox-LDL和MDA表达，其余55例(92％)肾组织中的肾小球内与正常组织的表达情况相同。所有糖尿病肾病肾小球内均有不同程度的Cu2+-ox-LDL沉积和SOD-1表达，大多沿着肾小球基底膜分布。10例检测了MDA和4-HNE的糖尿病肾病肾组织中肾小球内的MDA和4-HNE也均阳性。糖尿病肾病足细胞nephrin的表达减少。 结合临床病理资料分析，Cu2+-ox-LDL的沉积与糖尿病肾病患者的视网膜病变呈正相关(r=+0.46，P=0.01)，与其它临床病理参数无相关性；随Cu2+-ox-LDL在小球内的沉积增加，足细胞nephrin的阳性表达率呈下降趋势。SOD-1的表达与活检时的血清肌酐水平呈负相关(r=-0.57，P=0.0007)，与肌酐清除率呈正相关(r=+0.84，P=0.0000)，与肾间质纤维化和浸润程度负相关(r值分别为-0.46和-0.37，P值分别为0.006和0.03)，并与足细胞蛋白的表达呈正相关，与nephrin的相关系数为r=+0.59(P=0.0001)，与synaptopodin的相关系数为r=+0.58(P=0.0001)，与ZO-1也呈正相关(r=+0.56，P=0.0001)，但与Cu2+-ox-LDL的表达无显著相关性。2型糖尿病肾病足细胞的nephrin表达阳性率降低(34.43％)，有nephrin表达的患者蛋白尿程度显著低于无nephrin表达的患者(1.85±1.35vs3.67±3.80，t=2.064，p=0.048)。 结论：2型糖尿病肾病肾小球内均存在脂质氧化损伤，其中随着Cu2+-ox-LDL在肾小球内的沉积增多，足细胞蛋白nephrin的表达呈下降趋势。抗氧化物SOD-1在2型糖尿病肾病的肾小球内有不同程度的表达，表达程度与肾功能的改变和肾小球足细胞蛋白的完整性密切相关。足细胞neprhin的表达与2型糖尿病肾病的蛋白尿程度有关。 第二章H-2Kb-tsA58转基因小鼠肾小球足细胞株的分离、培养与鉴定 目的：利用H-2Kb-tsA58转基因小鼠的条件永生性从肾脏中分离、纯化和培养肾小球足细胞株。 方法：筛网法分离肾小球，免疫磁珠初步分离肾小球内皮细胞，限制性稀释法从结合磁珠后的细胞中纯化获取单细胞克隆后持续传代培养。间接免疫荧光法鉴定及筛选足细胞克隆，并对足细胞进行摄取Dil-LDL的功能检测。 结果：分离纯化后的细胞克隆在33℃有γ-干扰素诱导下具有无限增殖能力，37℃无γ-干扰素条件下细胞趋于分化成熟。所获得的足细胞在33℃有γ-干扰素和37℃无γ-干扰素条件下均表达足细胞抗原WT-1，33℃不表达成熟足细胞抗原synaptopodin，37℃无γ-干扰素培养两周后足细胞形成大量足突结构并特异性表达成熟足细胞的标志物nephrin和synaptopodin。33℃和37℃条件下足细胞均有摄取Dil-LDL的功能。 结论：本研究成功建立了具有分化成熟足细胞特性的条件永生性小鼠足细胞株，为体外研究足细胞的功能及其在肾脏疾病中的作用提供了细胞株。 第三章氧化型低密度脂蛋白对足细胞的损伤作用及机制 目的：在体外观察氧化型低密度脂蛋白对分化成熟的小鼠足细胞的作用，探讨氧化型低密度脂蛋白损伤足细胞后的效应和激活的信号通路，以及足细胞对氧化损伤刺激反应后抗氧化能力的变化。 方法：硫酸铜氧化法制备铜氧化修饰的低密度脂蛋白，分别用无血清培养液、50ug/ml氧化型低密度脂蛋白和低密度脂蛋白刺激小鼠足细胞，观察12小时和24小时两个时间点足细胞的损伤变化及其抗氧化物质SOD活性的改变。TUNEL检测足细胞的凋亡情况，间接免疫荧光法观察足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin和细胞骨架蛋白paxillin、F-actin的表达；westemblot观察nephrin表达的改变和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、糖原合成酶-3β(GSK-3β)两条信号通路的改变；分光光度法检测足细胞胞浆的SOD活性。 结果：24小时足细胞未发生凋亡现象，12小时各组nephrin表达无差异，24小时氧化型低密度脂蛋白刺激组nephrin表达显著降低，24小时氧化型低密度脂蛋白刺激组paxillin足突上的表达消失，F-actin重新分布。Westernblot的结果进一步证实，24小时nephrin在氧化型低密度脂蛋白刺激组的表达量显著降低。12小时MAPK和GSK-3β的活性无明显变化，24小时磷酸化的MAPK和GSK-3β在氧化型低密度脂蛋白刺激组显著增加。12小时氧化型低密度脂蛋白刺激的足细胞SOD活性较对照组增高19.94％，当刺激持续至24小时，较同一时间点的对照组仅增高7.3％。 结论：氧化型低密度脂蛋白刺激体外培养的小鼠足细胞24小时后，引起nephrin表达下降，细胞骨架蛋白重构，磷酸化的MAPK、GSK-3β比率增加，提示上述两通路的激活可能是造成nephrin表达下降和细胞骨架蛋白变化的原因。足细胞受氧化刺激的早期，SOD的活性增加可能是保护足细胞免于氧化损伤的因素之一。