【摘 要】
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背景:神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体肿瘤,其预后与众多临床和生物学特征有关。MYCN基因的超量表达是本病预后判断的重要指标之一,其和肿瘤的恶性分期、进展速度、耐药
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背景:神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体肿瘤,其预后与众多临床和生物学特征有关。MYCN基因的超量表达是本病预后判断的重要指标之一,其和肿瘤的恶性分期、进展速度、耐药性等有高度相关性,因此MYCN基因可成为神经母细胞瘤基因治疗的重要靶点。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是转录后基因沉默重要机制之一,其依靠小双链RNA降解mRNA,抑制相关基因表达。由于RNA干扰技术有高效的基因抑制作用,可以设计针对MYCN基因的siRNA抑制其超量表达。采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ(SYBR GREEN I)的实时定量RT-PCR可以有效并可靠地测定基因表达水平的变化。 目的:建立采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ(SYBR GREEN I)实时定量RT-PCR体系,检测神经母细胞瘤细胞系LAN-5mRNA表达;设计MYCN siRNA,研究神经母细胞瘤细胞系LAN-5转染MYCN siRNA后MYCN基因mRNA表达以及瘤细胞增殖的变化情况。 方法:建立采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ(SYBR GREEN I)实时定量RT-PCR体系,从神经母细胞瘤细胞(LAN-5)提取总RNA,采用该定量RT-PCR体系测定MYCN、GAPDH基因mRNA拷贝数,MYCN mRNA表达水平用MYCN copies/GAPDH copies表示。设计针对MYCN mRNA的3条19个碱基长度的siRNA,通过Lipofectamine2000转染超量表达MYCN基因的LAN-5细胞。转染前后MYCN mRNA表达水平的变化通过采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ(SYBR GREEN I)实时定量RT-PCR检测;细胞增殖情况通过MTT法检测。
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