非洲猪瘟（African Swine fever,ASF）与伪狂犬病（Pseudorabies,PR）分别由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus,ASFV）与伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染引起的猪高致死、传染性疾病。目前无商业化非洲猪瘟疫苗,两种疾病均给养猪业造成了巨大的经济损失。本研究以PRV-Fa经典毒株为载体通过CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）基因编辑技术将ASFV（Pig/HLJ/18）CD2v（EP402R）与p12（O61R）基因分别插入PRV-Fa株TK（UL23）及g I（US7）基因位点中,成功构建TK及g I缺失且重组表达ASFV CD2v与P12的重组弱毒株PRV-（35）g I-（P12）-（35）TK-（CD2v）。病毒传30代后通过PCR扩增、蛋白质免疫印迹（Western blot）与免疫荧光实验验证CD2v与P12在非洲绿猴肾上皮细胞（Vero）细胞中稳定表达,表明重组毒株遗传性状稳定。一步生长曲线与噬斑生长测定表明与野生型毒株PRV-Fa相比重组毒株复制能力减弱且攻毒后对小鼠不具致死能力,表明重组毒株毒力明显减弱。通过小鼠病理学评估、小鼠组织病毒拷贝数测定、小鼠体内淋巴因子检测与流式细胞术对T细胞分析发现重组毒株不会引起小鼠全身炎症反应及瘙痒,且可诱导T细胞增殖并激活T细胞诱导细胞免疫应答。为研究重组病毒是否能起到保护性免疫作用,用PRV-（35）g I-（35）TK与PRV-（35）g I-（P12）-（35）TK-（CD2v）对小鼠进行免疫,发现两者均100%保护PRV-Fa的攻击。体外通过酶联免疫吸附剂测定（ELISA）测定重组病毒免疫后可产生特异性抗体,并通过纯化的CD2v与P12刺激免疫后小鼠外周血单核淋巴细胞（PBMC）可诱导干扰素γ（IFN-γ）的表达,表明PRV-（35）g I-（P12）-（35）TK-（CD2v）具有较高的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性细胞免疫应答与体液免疫应答。该重组毒株为研究预防PR及ASF的新型疫苗提供了新的选择。