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研究目的：低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible transcription factor-1α，HIF-1α）是机体内诱导低氧基因和修复细胞低氧内环境的一个核心调节因子，是脏器组织适应低氧环境重要的转录因子，在无氧环境中被灭活，但在低氧环境中可被激活，参与了缺血再灌注、肿瘤或粘膜炎症等病理生理过程，有研究表明HIF-1α对急性肺损伤具有一定保护作用。巨噬细胞是机体重要免疫应答细胞，根据功能可分为M1型巨噬细胞（促进炎症反应，对组织造成炎症损伤）和M2型巨噬细胞（缓解免疫应答，起到组织修复功能）。正常情况下，M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞处于稳定平衡状态，但在一定条件下可相互转化，从而起到损伤机体或修复机体的功能。机械通气在给机体供氧时也可产生生物伤，促进促炎症因子的分泌。因此本论文的研究目的在于当机械通气形成机械通气相关性肺损伤（Ventilator-induced lung injury，VILI，炎症性损伤）时，在这个环境条件下，是否可促使巨噬细胞向M1型极化。同时探讨当机械通气形成机械通气相关性肺损伤时，机体存在炎症性低氧，HIF-1α是否被激活，如果是的话，进一步探讨HIF-1α如何调节巨噬细胞极化，研究HIF-1α激动剂(DMOG)激活并增加HIF-1α转录后，是否可抑制肺泡巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，同时可促进肺泡巨噬细胞向M2型极化（体外细胞实验和体内动物实验）以及研究增加HIF-1α的表达对小鼠机械通气相关性肺损伤起到的保护作用。
研究方法：本实验分为4个部分。
第一部分：机械通气对肺泡巨噬细胞极化的影响。
分体外细胞实验和体内动物实验。经分离和培养的小鼠肺泡巨噬细胞（mouse alveolar macrophages，AMs）分为对照组和牵拉（CS）组，对照组不进行处理；CS组：对肺泡巨噬细胞进行机械牵拉（一种循环牵拉模式，频率设为30 周期/分钟，0.5赫兹，牵拉4小时）。收集上清液检测肺泡巨噬细胞极化相关因子（M1型：IL-1β， IL-6，TNF-α；M2型：IL-10，TGF-β）含量的变化情况。动物实验选择ICR小鼠12只，分为对照组和机械通气（VILI）组，对照组不进行处理；VILI组，小鼠麻醉后气管切开接小动物呼吸机进行机械通气（VT=30 ml/kg，4h）制成机械通气相关性肺损伤模型。通气结束后进行心脏采血及肺泡灌洗收集肺泡灌洗液检测血清中及肺泡灌洗液中肺泡巨噬细胞极化相关因子的含量变化。
第二部分：机械通气对转录因子HIF-1α表达的影响。
首先进行细胞实验，将分离和培养的小鼠肺泡巨噬细胞分为对照组和CS组，对照组不进行处理；CS组：对肺泡巨噬细胞进行机械牵拉（频率：30 周期/分钟，0.5赫兹，牵拉4小时）。收集底层细胞使用Western Blot检测HIF-1α总蛋白、核蛋白、浆蛋白水平变化，PCR检测HIF-1α相关的靶基因（LDHA、PFKM、PDK1）的表达变化。然后进行动物实验，动物实验选择ICR小鼠12只，分为对照组和VILI组，对照组不进行处理；机械通气组，小鼠麻醉后气管切开接小动物呼吸机进行机械通气（VT=30 ml/kg，4h），收集肺组织使用Western Blot检测HIF-1α总蛋白、核蛋白、浆蛋白水平变化，PCR检测HIF-1α相关的靶基因（LDHA、PFKM、PDK1）的表达变化。
第三部分，增加或减少HIF-1α表达对肺泡巨噬细胞极化的影响
首先进行动物实验，选择ICR小鼠36只分为6组，对照组：不进行处理；VILI组：小鼠麻醉后气管切开接小动物呼吸机进行机械通气（VT=30 ml/kg，4h）；HIF-1α激动剂（DMOG）组：小鼠腹腔内注射DOMG1 mg，不进行机械通气；VILI+DMOG组：在小鼠腹腔内注射DMOG1 mg，4小时后进行机械通气（VT=30 ml/kg，4h）；HIF-1α抑制剂（棘霉素，Ech）组：小鼠腹腔内注射棘霉素30μg，不进行机械通气；VILI+Ech组：小鼠腹腔内注射棘霉素30μg，1小时后进行机械通气。收集血清液和肺泡灌洗液检测肺泡巨噬细胞极化相关因子（M1型：IL-1β，IL-6，TNF-α；M2型：IL-10，TGF-β）含量的变化情况。然后进行体外细胞实验，将分离培养的肺泡巨噬细胞分为4组，对照组，CS组，DMOG组，CS+DMOG组。DMOG组：细胞培养板中加入DMOG 1 M，不进行牵拉。 CS+DMOG组：细胞培养板中加入DMOG 1 M，4小时后进行机械牵拉（参数同CS组）。收集上清液检测泡巨噬细胞极化相关因子（M1型：IL-1β，IL-6， TNF-α；M2型：IL-10，TGF-β）含量的变化情况。
第四部分，增加HIF-1α表达在小鼠机械通气相关性肺损伤中的作用
选择ICR小鼠24只分为对照组，VILI组，VILI+DMOG组，DMOG组4组， DMOG组：小鼠腹腔内注射DOMG1 mg，不进行机械通气；VILI+DMOG组：在小鼠腹腔内注射DMOG1 mg，4小时后进行机械通气前。收集肺组织检测炎症因子含量变化及髓过氧化物酶（MPO）活性变化，进行支气管肺泡灌洗，检测灌洗液中蛋白浓度和细胞数量的变化及肺组织湿干重比（W/D）反映肺水含量，肺组织切片进行HE染色反映肺组织病理学改变。
结果：
第一部分：分离和培养的小鼠肺泡巨噬细胞经牵拉后M1型巨噬细胞极化相关因子（IL-1β，IL-6，TNF-α）含量上升（P＜0.05），M2型巨噬细胞极化相关因子（IL-10， TGF-β）含量降低（P＜0.05）。动物实验中，小鼠经大潮气量机械通气至机械通气相关性肺损伤使M1型巨噬细胞极化相关因子含量上升（P＜0.05），M2型巨噬细胞极化相关因子含量降低（P＜0.05）。
第二部分：体外细胞实验结果显示肺泡巨噬细胞经牵拉后HIF-1α总蛋白水平上升、细胞核蛋白水平上升、细胞浆蛋白水平降低，相关的靶基因（LDHA、PFKM、PDK1）表达增加（P＜0.05）。小鼠动物实验结果显示小鼠经大潮气量机械通气至机械通气相关性肺损伤使HIF-1α总蛋白水平上升、细胞核蛋白水平上升、细胞浆蛋白水平降低，同样相关的靶基因（LDHA、PFKM、PDK1）表达亦增加（P＜0.05）。
第三部分：小鼠动物实验结果显示VILI+DMOG组小鼠较VILI组小鼠的血清液及肺泡灌洗液中的M1型巨噬细胞极化相关因子含量降低（P＜0.05），M2型巨噬细胞极化相关因子含量上升（P＜0.05），VILI+ECH组小鼠较VILI组小鼠的血清液及肺泡灌洗液中的M1型和M2型巨噬细胞极化相关因子含量无明显变化（P>0.05）。此外在体外细胞实验中结果显示CS+DMOG组较CS组细胞上清液中M1型巨噬细胞极化相关因子含量降低（P＜0.05），M2型巨噬细胞极化相关因子含量上升（P＜0.05）。
第四部分：VILI+DMOG组小鼠较VILI组小鼠，促炎症因子下降（P＜0.05）、抗炎症因子上升（ P＜0.05 ）、肺泡灌洗液中细胞数量下降（ P＜0.05 ）、蛋白含量下降（P＜0.05）、W/D比值下降（P＜0.05）、MPO活性下降（P＜0.05）、HE染色显示病理损伤减轻（P＜0.05），可见，给予HIF-1α激动剂DMOG后，增加了HIF-1α转录表达，减轻了大潮气量机械通气相关性肺损伤中肺血管的高通透性和促炎症因子的释放，减轻肺水肿，减轻氧化应激损伤。
结论：研究证明了机械通气相关性肺损伤可以使肺泡巨噬细胞向M1极化，产生肺部炎症反应，进而导致肺损伤，同时存在的炎症性低氧可反应性激活HIF-1α的表达，我们认为这是一种保护性机制，但这种机体保护性反应不足以抵抗机械通气诱导的巨噬细胞M1极化和肺损伤。当给予HIF-1α激动剂DMOG后，增加了HIF-1α的表达，可以抑制肺泡巨噬细胞向M1型极化，促进肺泡巨噬细胞向M2型极化，抑制其促炎症因子的分泌，促进抗炎症因子的分泌，减轻氧化应激，并减轻肺血管通透性和缓解肺水肿，从而发挥肺保护作用。
研究方法：本实验分为4个部分。
第一部分：机械通气对肺泡巨噬细胞极化的影响。
分体外细胞实验和体内动物实验。经分离和培养的小鼠肺泡巨噬细胞（mouse alveolar macrophages，AMs）分为对照组和牵拉（CS）组，对照组不进行处理；CS组：对肺泡巨噬细胞进行机械牵拉（一种循环牵拉模式，频率设为30 周期/分钟，0.5赫兹，牵拉4小时）。收集上清液检测肺泡巨噬细胞极化相关因子（M1型：IL-1β， IL-6，TNF-α；M2型：IL-10，TGF-β）含量的变化情况。动物实验选择ICR小鼠12只，分为对照组和机械通气（VILI）组，对照组不进行处理；VILI组，小鼠麻醉后气管切开接小动物呼吸机进行机械通气（VT=30 ml/kg，4h）制成机械通气相关性肺损伤模型。通气结束后进行心脏采血及肺泡灌洗收集肺泡灌洗液检测血清中及肺泡灌洗液中肺泡巨噬细胞极化相关因子的含量变化。
第二部分：机械通气对转录因子HIF-1α表达的影响。
首先进行细胞实验，将分离和培养的小鼠肺泡巨噬细胞分为对照组和CS组，对照组不进行处理；CS组：对肺泡巨噬细胞进行机械牵拉（频率：30 周期/分钟，0.5赫兹，牵拉4小时）。收集底层细胞使用Western Blot检测HIF-1α总蛋白、核蛋白、浆蛋白水平变化，PCR检测HIF-1α相关的靶基因（LDHA、PFKM、PDK1）的表达变化。然后进行动物实验，动物实验选择ICR小鼠12只，分为对照组和VILI组，对照组不进行处理；机械通气组，小鼠麻醉后气管切开接小动物呼吸机进行机械通气（VT=30 ml/kg，4h），收集肺组织使用Western Blot检测HIF-1α总蛋白、核蛋白、浆蛋白水平变化，PCR检测HIF-1α相关的靶基因（LDHA、PFKM、PDK1）的表达变化。
第三部分，增加或减少HIF-1α表达对肺泡巨噬细胞极化的影响
首先进行动物实验，选择ICR小鼠36只分为6组，对照组：不进行处理；VILI组：小鼠麻醉后气管切开接小动物呼吸机进行机械通气（VT=30 ml/kg，4h）；HIF-1α激动剂（DMOG）组：小鼠腹腔内注射DOMG1 mg，不进行机械通气；VILI+DMOG组：在小鼠腹腔内注射DMOG1 mg，4小时后进行机械通气（VT=30 ml/kg，4h）；HIF-1α抑制剂（棘霉素，Ech）组：小鼠腹腔内注射棘霉素30μg，不进行机械通气；VILI+Ech组：小鼠腹腔内注射棘霉素30μg，1小时后进行机械通气。收集血清液和肺泡灌洗液检测肺泡巨噬细胞极化相关因子（M1型：IL-1β，IL-6，TNF-α；M2型：IL-10，TGF-β）含量的变化情况。然后进行体外细胞实验，将分离培养的肺泡巨噬细胞分为4组，对照组，CS组，DMOG组，CS+DMOG组。DMOG组：细胞培养板中加入DMOG 1 M，不进行牵拉。 CS+DMOG组：细胞培养板中加入DMOG 1 M，4小时后进行机械牵拉（参数同CS组）。收集上清液检测泡巨噬细胞极化相关因子（M1型：IL-1β，IL-6， TNF-α；M2型：IL-10，TGF-β）含量的变化情况。
第四部分，增加HIF-1α表达在小鼠机械通气相关性肺损伤中的作用
选择ICR小鼠24只分为对照组，VILI组，VILI+DMOG组，DMOG组4组， DMOG组：小鼠腹腔内注射DOMG1 mg，不进行机械通气；VILI+DMOG组：在小鼠腹腔内注射DMOG1 mg，4小时后进行机械通气前。收集肺组织检测炎症因子含量变化及髓过氧化物酶（MPO）活性变化，进行支气管肺泡灌洗，检测灌洗液中蛋白浓度和细胞数量的变化及肺组织湿干重比（W/D）反映肺水含量，肺组织切片进行HE染色反映肺组织病理学改变。
结果：
第一部分：分离和培养的小鼠肺泡巨噬细胞经牵拉后M1型巨噬细胞极化相关因子（IL-1β，IL-6，TNF-α）含量上升（P＜0.05），M2型巨噬细胞极化相关因子（IL-10， TGF-β）含量降低（P＜0.05）。动物实验中，小鼠经大潮气量机械通气至机械通气相关性肺损伤使M1型巨噬细胞极化相关因子含量上升（P＜0.05），M2型巨噬细胞极化相关因子含量降低（P＜0.05）。
第二部分：体外细胞实验结果显示肺泡巨噬细胞经牵拉后HIF-1α总蛋白水平上升、细胞核蛋白水平上升、细胞浆蛋白水平降低，相关的靶基因（LDHA、PFKM、PDK1）表达增加（P＜0.05）。小鼠动物实验结果显示小鼠经大潮气量机械通气至机械通气相关性肺损伤使HIF-1α总蛋白水平上升、细胞核蛋白水平上升、细胞浆蛋白水平降低，同样相关的靶基因（LDHA、PFKM、PDK1）表达亦增加（P＜0.05）。
第三部分：小鼠动物实验结果显示VILI+DMOG组小鼠较VILI组小鼠的血清液及肺泡灌洗液中的M1型巨噬细胞极化相关因子含量降低（P＜0.05），M2型巨噬细胞极化相关因子含量上升（P＜0.05），VILI+ECH组小鼠较VILI组小鼠的血清液及肺泡灌洗液中的M1型和M2型巨噬细胞极化相关因子含量无明显变化（P>0.05）。此外在体外细胞实验中结果显示CS+DMOG组较CS组细胞上清液中M1型巨噬细胞极化相关因子含量降低（P＜0.05），M2型巨噬细胞极化相关因子含量上升（P＜0.05）。
第四部分：VILI+DMOG组小鼠较VILI组小鼠，促炎症因子下降（P＜0.05）、抗炎症因子上升（ P＜0.05 ）、肺泡灌洗液中细胞数量下降（ P＜0.05 ）、蛋白含量下降（P＜0.05）、W/D比值下降（P＜0.05）、MPO活性下降（P＜0.05）、HE染色显示病理损伤减轻（P＜0.05），可见，给予HIF-1α激动剂DMOG后，增加了HIF-1α转录表达，减轻了大潮气量机械通气相关性肺损伤中肺血管的高通透性和促炎症因子的释放，减轻肺水肿，减轻氧化应激损伤。
结论：研究证明了机械通气相关性肺损伤可以使肺泡巨噬细胞向M1极化，产生肺部炎症反应，进而导致肺损伤，同时存在的炎症性低氧可反应性激活HIF-1α的表达，我们认为这是一种保护性机制，但这种机体保护性反应不足以抵抗机械通气诱导的巨噬细胞M1极化和肺损伤。当给予HIF-1α激动剂DMOG后，增加了HIF-1α的表达，可以抑制肺泡巨噬细胞向M1型极化，促进肺泡巨噬细胞向M2型极化，抑制其促炎症因子的分泌，促进抗炎症因子的分泌，减轻氧化应激，并减轻肺血管通透性和缓解肺水肿，从而发挥肺保护作用。