论文部分内容阅读
目的：维甲酸相关孤核受体α（Retinoid acid receptor related Orphan Receptorα，RORα）可能参与多种肿瘤的调控。二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）可诱导人胃癌细胞增殖抑制、分化与细胞周期G2/M期阻滞，其机制可能与RORα蛋白表达上调有关，但其具体机制不明，因此本研究通过microRNA干扰技术将RORα基因沉默，观察其对DADS诱导的增殖抑制与周期阻滞的影响，探讨DADS抑制人胃癌细胞作用的分子机制。 方法: 1.根据 GenBank提供的RORα基因序列设计4条 RNA干扰序列，命名为miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4，并设计1条非特异性序列作为阴性对照。合成各自的寡核苷酸链，退火后与 miRNA表达载体 pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR连接，转化扩增后测序，将含靶向RORα的miRNA的质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFpmiR-RORα转染SGC7901， MGC803细胞，建立稳转细胞系，通过Western blot验证miRNA-RORα对RORα表达的抑制作用； 2.细胞计数、MTT法和流式细胞术分析RORα表达下调对DADS诱导胃癌细胞增殖与周期的影响。 结果: 1.重组pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα-miRNA质粒经单酶切与DNA测序分析证明重组载体构建成功，荧光显微镜下观察可见转染细胞内的绿色荧光。Western blot结果显示，与未转染组相比，转染RORα-miRNA后使人胃癌SGC7901、MGC803细胞内RORα蛋白表达均明显降低（P<0.05）。 2.细胞计数结果显示，与未转染组比较，RORα-miRNA转染组细胞增殖率增加，且群体倍增时间缩短(P<0.05)，说明抑制RORα基因表达促进了SGC7901、MGC803细胞增殖。而阴性转染组增殖率、群体倍增时间无明显改变（P>0.05）。DADS处理后，各组细胞群体倍增时间均延长，细胞增殖被抑制，但miRNA干扰 RORα表达后的两组细胞经DADS处理后，其细胞群体倍增时间延长幅度明显低于DADS处理的未转染组(P<0.05)，说明抑制 RORα表达削弱了DADS诱导的增殖抑制作用。 3. MTT结果显示，RORα-miRNA转染可使SGC7901、MGC803细胞的增殖率（光吸收值）明显高于未转染组(P<0.05)，说明干扰 RORα表达可促进细胞增殖。而阴性转染组增殖率无明显改变（P>0.05）。分别加入15mg·L-1、30mg·L-1 DADS24h后，RORα-miRNA3转染的SGC7901、MGC803细胞的增殖抑制率分别为27.14％、33.48%，均明显低于DADS处理的未转染组36.15%、45.35%(P<0.05)，48h、72h和96h后也是一样的结果，提示干扰RORα表达削弱了DADS的抑制增殖作用。 4.流式细胞术发现，与未转染组比较，转染RORα-miR3后SGC7901、MGC803细胞周期中G0/G1期细胞百分比明显降低，而S期和G2/M期细胞百分比增高（P<0.05），且增殖指数也增高（P<0.05），说明干扰RORα表达后有促进细胞增殖作用，而阴性转染组各期百分比、增殖指数无明显改变（P>0.05）。15mg·L-1、30mg·L-1 DADS分别处理RORα-miR3转染组SGC7901、MGC803细胞24h后，G2/M期百分率均明显低于DADS处理的未转染组（P<0.05），表明干扰RORα表达可削弱DADS对SGC7901、MGC803细胞的G2/M期阻滞作用。 结论: 1. miR-RORα表达载体(pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα)转染细胞后可明显抑制人胃癌SGC7901、MGC803细胞中RORα表达。 2. microRNA抑制RORα表达后，可促进人胃癌SGC7901、MGC803细胞增殖，并且削弱DADS的增殖抑制及G2/M期阻滞作用，说明RORα表达上调可能是DADS抑制人胃癌细胞作用的分子机制之一。