论文部分内容阅读
干扰素（interferon,IFN）,是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子。自1957年Isaacs和Lindenmann首先发现干扰素以来,人们对IFN的研究、开发及应用从未停止过,目前IFN已被广泛应用于人医临床多种疾病的治疗。1980年WHO根据IFN抗原特异性的不同将其分为三类:IFN-α、IFN-β、IFN-γ;后来又依IFN作用的受体不同而分为两型:Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN,Ⅰ型包括IFN-α、β、ω、τ、δ等;Ⅱ型只有IFN-γ。相对而言,兽医界对动物干扰素的研究起步较晚。由病毒、细菌等病原微生物侵染动物所引起的各种传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展,同时也是人类健康的巨大隐患。因此,研究动物干扰素对动物传染性疾病的防治具有重大的经济价值和社会意义。国内外奶牛养殖场在奶牛养殖过程中,常面临多种疾病,例如:奶牛乳腺炎、口蹄疫、牛结核病等。疾病不但严重影响奶牛的产奶量和牛奶的质量,而且给奶牛场造成严重的经济损失。干扰素是细胞介导免疫的重要免疫分子,目前国内外学者利用基因工程技术研制牛干扰素γ及大量制备γ干扰素已取得了很多成果,而对IFN-α、IFN-β的基因工程技术制备还未见报道。近年来研究表明,干扰素β（IFNβ）与干扰素α（IFNα）一样,是一种具有多种生物学作用的重要细胞因子,虽然其与IFNα抗病毒作用机理相似,但IFNβ具有独特性,而这一独特性与IFNβ的抗病毒效果紧密相关。鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis,IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）引起的一种高度接触性的病毒性传染病。主要引起鸡的呼吸系统疾病、肾炎并伴随产蛋量和蛋品质的下降。本实验室陈汉阳博士对IBV的天然受体进行了探索性研究,通过将gAPN转染IBV的非敏感细胞(（PK-15,HeLa）,构建真核表达体系。通过间接免疫荧光、流式细胞术、半定量RT-PCR等试验证实IBV可以在这些转染后细胞上增殖。首次利用转基因细胞证明gAPN是IBV的天然受体之一（陈汉阳,2006）。为了进一步验证gAPN为IBV的天然受体,进行本动物实验验证是十分必要的。鉴于以上研究背景,本研究主要开展了一下内容:1.BoIFN-β基因的克隆、测序分析及其原核表达以植物血凝素（PHA）诱导的牛外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆扩增出编码牛干扰素β成熟蛋白基因（mBoIFNβ,498bp）。经测序结果证实扩增得到的mBoIFNβ与Genbank上所报道的牛干扰素β基因（E00137）的同源性为100%;牛β干扰素与野猪、马、猫、狗、人、鼠的氨基酸序列同源性分别为59%、50%、51%、46%、49%～51%、36%～43%。将mBoIFNβ插入pET-28a（+）表达载体,并转化宿主菌BL21,经IPTG诱导后,得到高效表达。表达产物经SDS-PAGE分析,证明BoIFNβ能够被诱导并高效表达,主要形成不溶性包涵体,大小约为28.6kDa。通过对宿主菌不同时间的诱导发现目的蛋白在诱导后4小时的表达量最高。2.BoIFN-β的真核表达载体的构建为了获得高效分泌表达的重组牛β干扰素,利用基因工程技术,将编码牛β干扰素成熟蛋白基因（mBoIFNβ,495bp）,亚克隆到含分泌信号肤序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mBoIFNβ。用化学方法（LiCl）将线性化的mBoIFNβ与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株,再以高浓度的G418筛选到多拷贝重组子。3.gAPN在IBV自然宿主鸡体内的表达研究为了进一步验证gAPN作为IBV的天然受体之一,本试验以鸡为实验动物,利用RT-PCR技术,分别检测了gAPN基因在鸡组织的转录水平。同时用免疫组化技术,检测了gAPN在不同鸡组织的表达。结果证实,gAPN基因在各组织器官的转录由高至低的顺序为:卵巢、输卵管、气管、脾、回肠、肺、肝、十二指肠、肾和心脏,与IBV的组织嗜性相一致。免疫组化证实,gAPN在小肠（哪一段?）、肾、肝、心、脾等具有不同程度的表达。此外,还用流式细胞术检测了鸡胚细胞表达gAPN的水平及与IBV的结合能力。