研究背景膀胱癌是人类泌尿生殖系统中最为常见的恶性肿瘤之一,随着人口总体老龄化,雾霾等空污染加重,工厂的致癌物质以及烟草的滥用等因素的潜在影响,膀胱癌的总体发病率在逐年攀升。中国癌症统计报告显示,2015年有80500例患者确诊膀胱癌,32900例死于膀胱癌。其中,非肌层浸润性膀胱癌(Non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC)约占膀胱肿瘤的80%,虽然经尿道膀胱肿瘤切除术(Transurethral resection of bladder tumor,TURBT)是治疗 NMIBC 的金标准,但术后5年复发率在50～70%,因此,对NMIBC患者术后辅以膀胱灌注治疗以预防肿瘤复发。纹裂霉素(Mitomycin C,MMC)可以通过破坏细胞DNA复制以及蛋內质合成发挥抗肿瘤活性,价格低廉,且灌注疗效与其他抗肿瘤药物无明显差异,性价比高,是临床中常用的膀胱灌注化疗药物。然而传统的MMC膀胱灌注化疗疗效有限,平均降低膀胱肿瘤复发率仅约14～17%,而且部分患者膀胱肿瘤甚至发生进展。这些不足主要归因于传统的膀胱灌注化疗方式。部分患者难以忍受MMC对膀胱黏膜的刺激,药物在膀胱内保留不足2h;也存在部分患者对MMC不敏感,虽然能保留MMC2h,但是随着尿液的产生,不仅稀释了 MMC浓度,而且过多的尿液促使周期性排尿,并不能保留MMC过多时间。为提高灌注疗效,单纯增加MMC浓度又会使副作用更凸显。总的来说,传统膀胱灌注方式使得药液在膀胱内滞留时间有限,作用时间较短,不能使时间、浓度依赖性的MMC有效的发挥抗肿瘤活性。多项新技术用于研究改善膀胱灌疗效,如药物联合透明质酸、二甲基亚砜灌注,可以提高药物在膀胱黏膜的吸收;化学热疗法或电化学方法也有报道用于膀胱灌注,以改善药物通透能力;光动力学治疗在膀胱灌注中也有潜在的优点。然而,以上新技术存在诸多缺点,如疗效欠佳,化学毒性,价格昂贵等,限制了其在膀胱灌注中的应用。近年来,利用药物载体增加药物浓度梯度、延长药物的作用时间以及进行靶向治疗是医药领域的研究热点。在笔者的前期实验中,成功制备了具有磁性和温敏特性的凝胶载体系统。该系统是一种特殊的原位成型沉淀(In situ forming depot,ISFD)系统,由壳聚糖(chitosan,CS),β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate,GP),Fe3O4 磁性纳米颗粒(Fe3O4magnetic nanoparticle,Fe3O4-MNP)组成,其最突出的特性是在制备完成时为液体,而在体温环境下,则能迅速转化为凝胶固体,形成药物的暂时储存仓库,黏附于周围组织。而且,该载体系统具有良好的生物相容性,生物降解性,生物黏附性,无毒性,药物缓释、控释,靶向等特性,是局部药物投送载体中最有前途的候选者。有学者研究发现,装载胰岛素的温敏凝胶系统注射入大鼠皮下后,可以缓释胰岛素超过5天。磁性载体搭载阿霉素灌注进入猪膀胱内,在外加磁场的牵引下,可以靶向治疗膀胱肿瘤,并且药物滞留时间较传统灌注方式明显延长。因此,笔者设想,磁性温敏凝胶载体系统或许可以用来改善传统膀胱灌注化疗方式,延长MMC在膀胱内作用时间,提高抗肿瘤活性,降低术后膀胱肿瘤复发率。研究目的本研究首先制备载药磁性温敏凝胶系统(Fe3O4-MMC-CS/GP),进行体内外抗肿瘤实验,并与MMC传统膀胱灌注化疗进行比较,明确该载药体系是否能提高MMC膀胱灌注抗肿瘤疗效;同时对该体系的凝胶转化、磁响应性、微观表征、溶胀性、降解性、药物释放特性、滞留能力等进行研究,以明确其增强MMC灌注化疗抗肿瘤活性的原理和机制。实验方法1.体外实验部分1.1载药磁性温敏凝胶系统(Fe3O4-MMC-CS/GP)的构建及磁响应性检测根据相关文献及笔者的前期实验,将Fe3O4-MMC-CS/GP制备方法简述如下:1)将一定量的CS溶于0.1mol/L的稀盐酸中,室温下磁力搅拌2h,过滤掉其中不溶性颗粒;2)蒸馏水溶解一定量的GP;3)将上述两种溶液置于冰浴中10min(或4℃冰箱中储存1Omin);4)在冰浴、CS溶液持续搅拌状态下,将GP溶液逐滴滴加入CS溶液中,直至形成均一透明溶液;5)在混合溶液中加入Fe3O4-MNP及MMC,通过超声分散或机械搅拌混匀。取小块凝胶置于盛蒸馏水的烧杯中,在外置磁铁的情况下,观察凝胶的磁响应性。1.2 Fe3O4-MMC-CS/GP体外凝胶转化时间检测及影响因素凝胶化时间采用经典的试管倒置法进行检测。在前期研究中,笔者已经明确,不同的CS和GP配比会影响凝胶转化时间,本研究中采用凝胶转化速度最快的CS/GP配比,用不同分子量(Molecular weight,Mw)和小同脱乙酸度(Deacetylation degree,DD)的CS在不同温度下进行凝胶转化时间检测,研究此三种因素对Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶转化时间的影响。1.3 Fe3O4-MMC-CS/GP体外药物释放检测采用透析法对Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶系统进行药物释放实验,明确其药物释放行为特点,并与传统膀胱灌注相比较。将适量的载药凝胶置于透析袋中,然后放入盛有溶出介质的烧杯中,37℃恒温水浴摇床,溶出介质每2h更换一次,以模拟排尿周期,收集的溶出样本过滤后-80℃储存,等待批量检测。MMC浓度检测采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC),统计数据后绘制浓度-时间曲线,释放总量时间曲线,并计算药时曲线下而积(Area under the curve,AUC),并与传统膀胱灌注比较统计学差异,同时研究CS分子量,Fe304-MNP以及载药量对该载药系统药物释放的影响。1.4扫描电子显微镜及数码显微镜检测Fe304-MMC-CS/GP凝胶表征Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶化后冻干,取少量样品,喷金增加导电性,置于扫描电子显微镜(Scanning electronmicroscope,SEM)下观察其内部结构并进行分析;取适量凝胶制作冰冻切片,然后行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色,置于数码显微镜下观察其内部结构并拍摄数码照片。1.5溶胀及降解检测为检测Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶吸水溶胀及储药能力,评估体内应用安全性及降解速率,采用重量分析法检测其溶胀率及降解速率。溶胀实验:称量一定量的干凝胶,放入PBS中,间隔一定时间取出凝胶,滤纸擦干表面水分,称量湿重,计算溶胀率。分析Fe3O4-MNP及MMC对凝胶溶胀的影响。体外降解实验:称量一定量的干凝胶,放入PBS缓冲液中,37℃水浴摇床,每天记录凝胶干重,并更换PBS缓冲液,计算降解速率。分析溶菌酶、Fe3O4-MNP及MMC对凝胶载体系统降解的影响。1.6 Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶系统体外抗肿瘤细胞活性检测明确Fe3O4-MMC-CS/GP对肿瘤细胞活性的影响,并与传统MMC膀胱灌注比较抗肿瘤疗效,采用CCK-8试剂盒进行检测。96孔板接种T24细胞后分为5组,分别接受不同处理,组1:空白对照组,无特殊处理;组2:外加磁场;组3:外加磁场+Fe3O4-CS/GP凝胶;组4:外加磁场+MMC溶液;组5:外加磁场+Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶。每2h更换培养基,模拟周期性排尿。处理24h后加入CCK-8试剂进行光密度(Optical density,OD)值测量。比较Fe3O4-MMC-CS/GP与传统膀胱灌注MMC溶液抗肿瘤细胞活性的差异。1.7 Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶体外诱导肿瘤细胞凋亡检测因MMC主要通过诱导肿瘤细胞发生凋亡来起到抗肿瘤作用,因此笔者采用流式细胞仪来分析Fe3O4-MMC-CS/GP对肿瘤细胞的凋亡诱导作用,并与MMC溶液的凋亡诱导相比较。T24细胞接种6孔板,分组处理如实验1.6所述。24h后收集处理细胞,用Annexin V-FITC和PI进行双染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡。2.体内实验部分2.1 Fe3O4-MMC-CS/GP体内滞留实验为明确磁性凝胶载体系统是否能延长MMC灌注后在膀胱腔内存留时间,笔者用雌性大鼠进行了体内滞留实验。新鲜配制Fe3O4-MMC-CS/GP体系液体溶液,用自制3F导尿管对27只雌性Wistar大鼠进行膀胱灌注,每只大鼠灌注0.1ml。灌注治疗完成后的大鼠置于0.4T磁场的环境中饲养。灌注后在2,4,6,8,10,12,24,48,72h分别处死3只大鼠,解剖取出大鼠膀胱,做冰冻切片后行HE染色,观察灌注后不同时间点Fe3O4-MMC-CS/GP在膀胱内的存留情况。2.2 Fe3O4-MMC-CS/GP体内释放实验为进一步验证、分析MMC从磁性凝胶载体中释放的规律,笔者用Wistar大鼠进行Fe3O4-MMC-CS/GP的体内释放实验。雌性Wistar大鼠麻醉后,导尿排空膀胱,实验组灌注0.1ml的Fe304-MMC-CS/GP溶液(含0.1mg的MMC),对照组灌注0.1ml的MMC溶液(同样含0.lmg的MMC)。灌注后将大鼠置于0.4T磁场的代谢笼中,并开始收集2,4,6,8,10,12,24,48,72h时间段内的尿液,过滤后置于-80℃,等待HPLC批量检测MMC浓度,绘制浓度-时间曲线,MMC释放量-时间曲线,计算AUC,分析Fe3O4-MMC-CS/GP药物缓释行为,并与传统MMC灌注相比较。2.3 Fe3O4-MMC-CS/GP膀胱灌注体内抗肿瘤实验分析并比较Fe304-MMC-CS/GP与传统MMC膀胱灌注体内抗肿瘤疗效。32只雌性Wistar大鼠随机分为4组。所有大鼠在成瘤期正常饮食,于饮水中添加BBN喂养8周。10周后所有大鼠进入膀胱灌注治疗期,组1灌注PBS,组2灌注Fe3O4-CS/GP,组3灌注MMC溶液,组4灌注Fe3O4-MMC-CS/GP。所有大鼠每周灌注1次,共6周。组2、4给予外加磁场处理。20周后处死所有大鼠,解剖留取大鼠膀胱、双侧输尿管及双肾,统计各组大鼠膀胱内肿瘤大小及数量并进行对比分析。2.4生存率评估为进一步评价Fe3O4-MMC-CS/GP膀胱灌注抗肿瘤疗效以及对生存率的影响,从膀胱灌注治疗期开始,统计各组大鼠生存率及死亡率,并绘制生存曲线,比较各组大鼠生存率差异。2.5免疫组织化学评估肿瘤凋亡膀胱肿瘤在MMC的作用下出现凋亡,是MMC抗膀胱肿瘤的重要作用机制。为进一步对比分析Fe3O4-MMC-CS/GP与单纯MMC溶液的体内抗肿瘤作用强弱,用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)分析各组大鼠肿瘤的凋亡情况。将各组大鼠膀胱肿瘤放入4%多聚甲醛中固定24h,石蜡包埋后切片,采用cleaved caspase-9和cleaved caspase-3抗体免疫组化染色的方法评估各组大鼠膀胱肿瘤的凋亡强弱。2.6统计分析使用Graphpad Prism 5.0对各实验数据进行统计学处理。根据数据类型选用单因素方差分析、Fisher卡方检验或配对t检验进行统计分析。本实验研究中计量资料以平均值±标准差表示,选用双侧检验。P<0.05为差异有统计学意义。实验结果1.1载药磁性温敏凝胶(Fe304-MMC-CS/GP)构建成功并具有良好的磁响应性笔者用磁性温敏凝胶成功装载了 MMC,室温下该体系为流动的液体,性质均一,呈黑色,有一定的黏度,流动性好。加热至37℃时,该体系迅速由液体转变为固体,呈凝胶状,性质均一,质地略柔软,不易变形,但施加强作用力后可破裂。取小块Fe304-MMC-CS/GP凝胶置于盛水的烧杯中,在外加磁场的作用下,凝胶迅速移动并吸附于烧杯壁上,表现出良好的磁响应性。1.2 Fe3O4-MMC-CS/GP体外凝胶化时间检测及影响因素笔者测试了 3种Mw以及2种DD的CS在不同温度下的凝胶转化时间,结果显示Mw、DD以及温度均可以影响Fe3O4-MMC-CS/GP由液体转化为固体凝胶的速率。在同一温度下,随着Mw的增加,DD的升高,凝胶转化时间明显缩短;同一种CS配制的Fe3O4-MMC-CS/GP体系,在较高温度时,凝胶转化时间有所缩短。1.3 Fe3O4-MMC-CS/GP具有良好的缓释药物特性Fe3O4-MMC-CS/GP在溶出介质中持续释放MMC,2h药物浓度达峰值,此后药物浓度逐渐下降,呈现出先快后慢的释放趋势。药物体外持续释放时间约24h,而且突释浓度显著降低(75.33 ±0.85μg/ml,较对照组下降23.48%)。对照组模拟传统膀胱灌注,单纯MMC溶液浓度在前2h保持最高,突释强(98.44± 0.52 μg/ml),更换溶出介质后,浓度为0,且此后无MMC继续释放。两者AUC无明显差异。因此Fe304-MMC-CS/GP凝胶具有良好的缓释药物作用,可以持续释放MMC,抗肿瘤作用时间明显长于传统膀胱灌注。Mw以及MMC含量会轻微影响凝胶载体系统的缓释行为,但不显著,Fe3O4-MNP对药物释放几乎无影响。1.4扫描电镜及数码显微镜检测Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶表征扫描电镜下观察冻干CS/GP凝胶,可以观察到凝胶成疏松多孔的网络结构,孔径大小比较均一,基质表面光滑;Fe3O4-MMC-CS/GP同样呈现疏松多孔的网络结构,但基质表面呈粗糙的颗粒状,因MMC及Fe3O4-MNP黏附或包埋于基质表面及内部而产生。数码显微镜观察凝胶冷冻切片,凝胶因HE染色呈现红色,同样为疏松多孔的网络结构,性质均一,可见黑色的Fe3O4-MNP颗粒,高倍镜下可观察到蓝色的MMC颗粒。载药体系的微观表征,有利于液体进入凝胶内部,使装载的药物得以溶出,并被运送至凝胶外,产生药物释放行为。1.5 Fe3O4-MMC-CS/GP具有良好的溶胀及降解特性实验数据显示,在PBS溶液中,CS/GP与Fe3O4-MMC-CS/GP干凝胶会在1h内迅速溶胀,几乎达峰值,溶胀率分别为255.19%±16.02%和196.64%±22.63%,因此该凝胶系统有着良好的吸水能力,有利于MMC的溶出、暂时储存及缓释。Fe3O4-MMC-CS/GP的溶胀率略低,主要是由于MMC及Fe3O4-MNP占据了凝胶内部部分空间,导致吸水量相对减少所致。体外降解实验显示,在不含溶菌酶的PBS溶液中,CS/GP与Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶降解缓慢,10天约降解了20%,而在含溶菌酶的PBS溶液中,两种凝胶系统降解速度明显加快,10天降解了约80%,可以预测该凝胶系统在体内有着良好的生物降解性。1.6 Fe3O4-MMC-CS/GP体外抗肿瘤细胞活性较单纯MMC溶液更强CCK-8实验结果显示,在中、低剂量 MMC实验中,单纯MMC溶液处理以及Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶处理后,其 OD值明显低于不含MMC处理的前3组,且Fe3O4-MMC-CS/GP处理组的OD值要低于单纯MMC溶液处理组的 OD 值(中剂量组:0.537 ±0.009 vs.0.323 ± 0.003,P= 0.0007<0.001;低剂量组:1.727 ±0.029 vs.0.626 ±0.010,P=0.0003<0.001),且差异有统计学意义,提示Fe3O4-MMC-CS/GP体外抗膀胱癌细胞活性更强。在高剂量MMC实验中,虽然差异无统计学意义,但Fe3O4-MMC-CS/GP的OD值仍低于单纯MMC溶液处理组。1.7 Fe304-MMC-CS/GP凝胶体外诱导更多肿瘤细胞发生凋亡细胞凋亡流式检测结果显示,单纯MMC处理以及Fe304-MMC-CS/GP处理组凋亡细胞数目显著增加,明显高于不含MMC处理的前3组,且Fe3O4-MMC-CS/GP组凋亡细胞数目显著多于MMC处理组,分别为27.33%±4.51%和10.20%± 2.80%,差异具有统计学意义。提示相同条件下Fe304-MMC-CS/GP凝胶诱导更多T24肿瘤细胞发生凋亡。2.1 Fe3O4-MMC-CS/GP在膀胱内具有强大的滞留特性通过留取不同时间点的人鼠膀胱组织,切片后HE染色观察发现,灌注后的Fe3O4-MMC-CS/GP混合溶液在膀胱腔内形成凝胶并黏附于膀胱壁,随着时间的流逝,Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶在腐蚀、酶解等作用下质量逐渐减少,灌注后72h留取的大鼠膀胱中,仍可以观察到少量的凝胶黏附于膀胱壁,且高倍镜下可见凝胶中的MMC颗粒。提示Fe3O4-MMC-CS/GP体内滞留时间可长达72h。2.2 Fe3O4-MMC-CS/GP体内释放实验大鼠体内释放试验显示,Fe3O4-MMC-CS/GP凝胶在大鼠膀胱腔内释放MMC长达72h,与单纯MMC溶液灌注相比,延长了约17倍,半衰期增加至5.34±1.67h。从释放行为上看,Fe3O4-MMC-CS/GP的缓释作用使MMC释放更加平稳,释放时间延长,无明显药物突释。药时曲线下面积结果显示,Fe3O4-MMC-CS/GP较传统单纯MMC灌注有着更明显的优势(418.70±12.79 vs.191.70± 57.45,P=0.0182<0.05),生物利用度增加了 118.41%。不仅如此,MMC作用时间延长,导致通过膀胱黏膜吸收的MMC量增加了 172.44%。2.3 Fe304-MMC-CS/GP体内抗肿瘤活性较传统MMC灌注更强4组大鼠经过成瘤期,膀胱灌注治疗期结束后,全部处死,统计结果显示,组1、组2中所有大鼠均存在膀胱肿瘤,且肿瘤体积较大,基底宽,活动度差,部分肿瘤表面出现白色钙化沉淀,两组中均存在肿瘤侵及输尿管引起梗阻,致同侧输尿管、肾扩张积水的大鼠病例。组3(MMC)、组4(Fe304-MMC-CS/GP)的膀胱肿瘤体积较小,且组4中的平均肿瘤体积明显小于组3(3.30±0.56 mm3 vs.5.88 ±0.65 mm3,P = 0.0083),抑制肿瘤体积生长43.88%。但成瘤大鼠的膀胱内平均肿瘤数目上无明显差异。2.4 Fe3O4-MMC-CS/GP灌注治疗组大鼠具有最高的生存率4组大鼠从膀胱灌注治疗期开始观察统计生存、死亡数目,并绘制生存曲线,至20周时结束。结果显示,组1、组2中因终点事件死亡大鼠数目分别为5 只和4只,MMC灌注组因终点事件死亡大鼠1只,Fe3O4-MMC-CS/GP灌注组无终点事件出现。因此,组4生存率较其他三组高,且差异具有统计学意义(P= 0.0261<0.05)。2.5免疫组织化学评估肿瘤凋亡4组大鼠膀胱肿瘤经免疫组化染色显示,cleaved caspase-3在组1、组2中染色较浅,表达较低,而经过MMC及Fe3O4-MMC-CS/GP治疗的组3、组4中,表达增高。经软件Image-Pro Plus 6.0处理后统计各组切片每个视野组织面积(Area)及积分光密度值(IOD),并计算IOD/Area,结果提示组4中cleaved caspase-3 蛋白表达明显高于组 3(159.64± 14.95 vs68.32± 14.31,P<0.0001),差异具有统计学意义,提示组4中肿瘤细胞凋亡更明显。cleaved caspase-9是caspase-3上游caspase-9的活化形式,表达趋势与cleaved caspase-3相同,同样提示组4中更多肿瘤细胞发生凋亡。实验结论在本实验研究中,笔者成功将MMC与磁性温敏凝胶载体相结合,制备了一种新型的膀胱灌注系统Fe3O4-MMC-CS/GP。该系统具有良好的磁响应性,在室温下为流动的液体,灌注进入膀胱后能迅速转化为凝胶,黏附于膀胱壁或在外加磁场引导下黏附于靶点。该凝胶系统具有无毒性、良好的组织相容性及生物降解性,体内、体外均缓慢释放MMC,并且延长MMC在膀胱内的滞留时间,增加膀胱黏膜对MMC的吸收,与传统膀胱灌注相比,具有更好的抗肿瘤细胞活性,能诱导更多的肿瘤细胞凋亡,提高膀胱肿瘤大鼠模型的存活率。