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蒽环类化合物是一类有效的肿瘤抑制剂,阿霉素（adriamycin,ADM）作为蒽环类临床使用最广泛的药物,在肿瘤化疗方面的作用已被肯定。目前阿霉素通过嵌入DNA碱基片段中导致肿瘤细胞复制障碍,以及干扰拓扑异构酶II（topoisomerase II,TOPO I I）发生肿瘤核酸去稳定的治疗作用机制已被确认。临床使用阿霉素近50年,发现阿霉素除了可导致一些副作用外,其引发的耐药性频繁发生,相应的机制不明,提示有必要进一步解析阿霉素的作用机制,完善其药理学研究。本研究从筛选和确认新的阿霉素作用靶点入手,以人源蛋白芯片作为材料,建立阿霉素作用靶点蛋白的筛选方法,系统解析靶点蛋白与阿霉素作用机制及耐药的关联性,补充和完善对阿霉素药理作用的认识。主要结果如下:1.可视化ADM示踪化合物的设计与制备以药物化合物与生物大分子相互作用为基础,兼顾相互作用的位阻效应和药物活性的保持,设计了生物素-氨基己酸为中间体,配以Cy5标记的亲和素形成的可视化分子探针。考虑除了蒽环类药物,其他药物大多无荧光,基于阿霉素的自发光,设计合成了生物素化阿霉素双荧光系统,借助其自发荧光对比验证生物素化示踪探针的有效性,为后期芯片筛选平台的建立提供基础。采用DMAP、DCC催化,一步法合成了长链生物素化ADM,理化分析与理性设计一致。生物学实验发现该长链生物素化ADM可与亲和素磁珠有效结合（结合率≥93.7%）;长链生物素化ADM和ADM对乳腺导管上皮细胞癌MCF7/W细胞和多药耐药MCF7/ADM细胞的IC50无显著差异,激光共聚焦发现该长链生物素化ADM在细胞内的定位与ADM一致。以人源化蛋白芯片为材料,长链生物素化ADM探针显示出较好的结合示踪效果,筛选出14种ADM结合靶点蛋白:TNF AIP6,APOA2,DYNLL1,TRMT112,MGAT1,SLC22A6,COASY,CMPK1,COX6B2,CLIC2,ZNF684,TRDMT1,H3F3B,DVL2。2.ADM作用靶点CMPK1的确认以上述筛选获得的14种ADM结合靶点蛋白为基础,在人源化蛋白芯片上,采用A DM与长链生物素化ADM探针定量竞争方法认证了SLC22A6、CMPK1和COX6B2蛋白为ADM结合蛋白;采用HEK293细胞瞬时表达了上述筛选获得的14种ADM结合靶点蛋白,生物膜层表面干涉（biolayer interferometry,BLI）技术分析认证了SLC22A6、CMPK1、TRMT112和DYNLL1蛋白为ADM结合蛋白。综合两种方法认证的ADM结合蛋白,选取CMPK1为研究对象,微量热涌动技术（microscale thermophoresis,MST）检测其与ADM的Kd值为1.2±0.5μM;计算机模拟对接分析显示,CMPK1与ADM间存在氢键和离子键形成的相互作用可能。3.ADM与CMPK1的作用机制研究CMPK1是DNA前体物质的磷酸化和药物激活激酶。以CMPK1酶学性质为基础,建立了基于HPLC分析CMPK1催化产物的定量分析方法,发现ADM可上调以CMP、dCMP、UMP为底物的CMPK1的磷酸化活性。ADM浓度为30μM时,CMPK1的酶活增加程度最大;添加ADM于反应体系可提高酶的活性,且不受DTT、NaF、EDTA等CMPK1活性调节剂的干扰。实验发现ADM可以有效地提高细胞内CMPK1作用前体药物吉西他滨对胰腺癌细胞的抑制作用,其机制是通过ADM对细胞内CMPK1活性的干预引起的。4.CMPK1低表达与乳腺癌细胞阿霉素耐药的相关性研究以上述建立的14种ADM结合靶点蛋白基因瞬时表达的HEK293细胞为材料,体外药物干预培养实验发现转染了CMPK1的细胞对ADM的药敏性变化最大。RT-PCR技术分析MCF7/W和MCF7/ADM细胞中14种基因的变化,发现CMPK1基因在耐药细胞中的转录水平明显低于药物敏感型细胞,western blot半定量实验验证了CMPK1蛋白表型与转录水平的一致性。siRNA部分沉默药物敏感细胞MCF7/W中的CMPK1的蛋白水平后,细胞也表现为对ADM的敏感性降低,提示了CMPK1的表达与MCF7细胞对ADM的药敏性呈正相关。本研究确认了CMPK1是ADM的结合靶点蛋白,论证了ADM对CMPK1的功能干扰提升吉西他滨治疗肿瘤的作用,阐述了ADM与CMPK1相互作用对乳腺导管上皮细胞癌抵抗ADM的耐药机制。