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创伤弧菌（Vibrio vulnificus,V.vulnificus）是一种适度嗜盐性的革兰氏阴性海洋弧菌。创伤弧菌可以感染鱼类和人类致病,人主要通过食入未煮熟的带菌海产品或伤口接触海水感染。食入性感染的患者早期会出现胃肠炎型症状,发展为脓毒症的患者病死率超过50%。流行病学研究表明具有肝病、糖尿病等免疫力低下的人群易感创伤弧菌,而感染后发生脓毒症患者中肝病患者占首位,其中酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）所占比例较高。但也有部分创伤弧菌感染患者没有基础性疾病,2006年美国《Emerging Infectious Diseases》杂志首次报道了健康人感染创伤弧菌的病例,将创伤弧菌列入最危险的细菌之列。我国海域辽阔,创伤弧菌分布广泛,海军战士长时间接触海水和海洋生物,因此需要警惕创伤弧菌的感染。创伤弧菌引起的原发性脓毒症通常伴随有血小板减少症,越来越多的研究表明:血小板除了参与机体凝血过程外,其在机体炎症反应、脓毒症的发生发展过程中也起着重要作用。活化的血小板能分泌P-选择素（CD62P）、释放微囊泡或产生CD40配体（CD40L）等重要的免疫调节因子,还能通过P-选择素与中性粒细胞形成复合体（platelet-neutrophil complex,PNC）,在炎症早期参与白细胞的趋化。CD62P和CD40L参与了淋巴细胞、巨噬细胞和内皮细胞的激活,可以促进免疫细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子,引起“细胞因子风暴”,在脓毒症的发生中起重要作用。除细胞因子外,降钙素原（procalcitonin,PCT）也可作为脓毒症的辅助诊断及预后指标。多项研究表明金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、血液链球菌和幽门螺杆菌可直接或间接激活人血小板,并参与引起脓毒症;但在创伤弧菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌等常见致病弧菌中还未见报道。目前现有报道的毒力因子和致病假说还难以解释创伤弧菌急性感染引起脓毒症的机制。因此,本课题主要关注以下科学问题:创伤弧菌感染后能否激活血小板?如何激活血小板?血小板活化和创伤弧菌在健康人以及ALD患者中引发的脓毒症是否存在联系?针对上述问题,本研究以“创伤弧菌-血小板相互作用”为起点来探索创伤弧菌激活血小板并参与引起脓毒症的致病机制,为我国海军后勤卫生防控建立高效率的针对海洋致病弧菌的预防、诊断和治疗方案提供理论依据,为创伤弧菌脓毒症救治药物的研发提供线索。研究内容主要分为三个部分:1.创伤弧菌小鼠感染模型的转录组与血小板活化分析（1）创伤弧菌小鼠感染模型的转录组分析:（1）通过慢性酒精喂养加急性酒精灌胃再慢性酒精喂养,我们构建了C57BL/6N小鼠的ALD模型。（2）通过ALD和健康对照小鼠灌胃创伤弧菌脓毒症病人分离株YJ016（或LBS）,我们模拟了创伤弧菌食入性感染。在灌胃12 h后收集小肠、全血样本,进行RNA-seq分析。结果显示:同LBS灌胃相比,ALD和对照小鼠在YJ016灌胃后,小肠组织中小板活化相关的基因表达水平存在差异,对应的GO、KEGG、Reactome富集分析结果分别为:血液微粒、血小板α颗粒（仅存在于ALD小鼠）;补体与凝血级联反应;血小板脱颗粒、对血小板胞浆Ca2+升高的反应。（2）创伤弧菌小鼠感染模型的血小板活化分析:（1）通过小肠组织CD62P的免疫组化,我们发现在YJ016灌胃后,ALD和对照小鼠小肠组织中CD62P均升高;通过酶联免疫吸附（ELISA）检测血浆可溶性CD62P（s CD62P）、可溶性CD40L（s CD40L）,我们发现ALD和对照小鼠血浆血小板活化水平在YJ016灌胃后升高,且ALD组高于对照组。（2）通过ELISA检测血浆PCT,我们发现ALD和对照小鼠血浆中PCT在YJ016灌胃后升高,且ALD组高于对照组;相关性分析表明:血浆中s CD62P、s CD40L等血小板活化指标与PCT呈正相关。2.创伤弧菌激活人血小板的分子机制（1）创伤弧菌中血小板活化刺激元的鉴定:（1）为了确定创伤弧菌的哪些组分激活了血小板,我们分别将YJ016的菌体或对数期培养物上清与人血小板孵育,通过流式细胞仪检测血小板表面CD62P的表达,发现YJ016培养物上清可激活血小板释放CD62P,而用胆固醇和抗VVH抗体孵育后的上清则不能激活血小板。因此推测创伤弧菌可能通过分泌毒素-胆固醇依赖型成孔毒素VVH来激活人血小板。（2）因此,通过基于p DS132自杀载体的无痕基因敲除技术,我们构建了vvhA基因敲除株YJ016-ΔvvhA,通过流式细胞术检测血小板表面CD62P的表达与PNC的形成、纳米流式细胞术检测血小板源性微囊泡的释放等血小板活化现象。结果显示:vvhA基因敲除后的YJ016培养物上清不能激活血小板,VVH是YJ016分泌上清中唯一能激活血小板的细菌刺激元。（3）通过硫酸铵沉淀、阴离子层析、疏水层析、超滤等方法,我们从YJ016培养物的上清中纯化得到了天然的VVH,发现VVH同培养上清一样能激活血小板CD62P及微囊泡的释放,并诱导PNC的形成,再次明确了VVH对血小板的激活作用。（2）VVH激活血小板的分子机制探索:通过检测血小板重要信号通路分子的抑制剂对VVH诱导CD62P表达的影响以及参与血小板脱颗粒的重要细胞骨架分子-肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化,我们探索了VVH激活人血小板的分子机制。（1）通过PLC特异性抑制剂U73122、MLCK特异性抑制剂ML-7、ROCK特异性抑制剂Y27632等与血小板孵育,发现U73122、ML-7可阻断VVH激活血小板,即VVH通过PLC-IP3/DAG-MLCK(而非Rho-ROCK-MLC或外Ca2+内流)通路激活血小板。（2）通过EGTA螯合血浆中的Ca2+及调节缓冲液中Ca2+两种方式,我们发现细胞外的Ca2+是VVH诱导血小板活化的必要条件。结合（1）（2）结果与VVH的成孔特性,我们推测VVH可能在细胞膜表面成孔引起Ca2+内流,进而通过G蛋白偶联受体等激活PLC-IP3/DAG-MLCK通路,导致血小板的活化。3.VVH在体内感染中的作用研究（1）VVH在脓毒症中的作用:（1）LBS、YJ016-ΔvvhA和YJ016灌胃ALD和对照小鼠12、72 h后,我们通过Luminex技术检测血浆中的IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等17种细胞因子,结果显示:YJ016和YJ016-ΔvvhA在感染早期（12 h）诱导的促炎因子具有差异。（2）感染早期（12 h）小鼠的血液细菌载量和血浆PCT检测结果显示:YJ016和YJ016-ΔvvhA在感染早期（12 h）血液细菌载量未见明显差异;而在ALD小鼠感染YJ016后,血浆PCT含量显著高于YJ016-ΔvvhA。此外,ALD小鼠感染YJ016后的细菌载量和PCT均高于对照组小鼠。（2）VVH在血小板活化中的作用:与YJ016-ΔvvhA基因敲除株感染组相比,YJ016灌胃感染组显示:（1）ALD和对照小鼠小肠组织中的CD62P均升高（免疫组化）;ALD和对照小鼠血浆中s CD62P、s CD40L水平也更高。（2）通过血细胞分析仪对小鼠血小板计数,小鼠血小板数量在LBS、YJ016-ΔvvhA和YJ016各组之间未见明显差异。（3）创伤弧菌感染血小板活化与脓毒症的相关性分析:以s CD62P、s CD40L作为评价血小板活化水平的指标,以3个主要促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和PCT作为反映脓毒症严重程度的指标。相关分析表明,s CD62P、s CD40L与IL-1β、TNF-α、IL-6、PCT呈正相关。综上,本研究发现VVH作为创伤弧菌重要的血小板活化刺激元,可通过PLC-IP3/DAG-MLCK通路激活人血小板,并在创伤弧菌感染早期参与了血小板的激活和脓毒症的发生,且血小板活化水平与脓毒症严重程度呈正相关。本研究首次通过ALD和健康小鼠两种模型揭示了创伤弧菌-血小板相互作用参与引起脓毒症的机制,为创伤弧菌的易感人群-肝病患者的重症治疗提供线索,为以血小板重要信号分子为靶点的脓毒症救治药物的研发提供了理论依据。