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作为世界上最重要的粮食作物之一,水稻在生产栽培过程中经常受干旱等非生物胁迫的影响。干旱等逆境胁迫已成为水稻减产的主要因素之一。随着水稻基因组测序的完成及后基因组时代的到来,利用功能基因组学方法来挖掘与旱胁迫相关基因,并解析其功能,对于进一步在育种实践中选育高抗旱性品种具有重要的意义。本实验前期研究发现,一个预测线粒体定位的Os04g0117100(LOC-Os04g02670)基因在水稻活性氧释放关键酶基因OsNOX2缺失突变体中剧烈下调,且与OsNOX2基因有共表达关系,可能参与了OsNOX2介导的水稻抗旱相关途径。该水稻Os04g0117100基因与动物中功能为线粒体定位的ATP合酶亚基具有同源性,但其在水稻中的生物学功能未知,因此我们将其命名为OsmtATPS1。本研究拟通过对OsmtATPS1全长cDNA序列克隆,生物信息学及相关分子生物学分析,初步阐明了OsmtATPS1基因的功能。主要研究内容和结果如下:(1)利用RT-PCR方法,成功克隆到OsmtATPS1基因cDNA全长。生物信息学分析表明OsmtATPS1基因编码的多肽仅有52个氨基酸,其11~52位氨基酸区段含有线粒体ATP合酶F0部分E亚基结构域;该蛋白高级结构有一个亲水部分和一个疏水部分,中间有一个α螺旋。OsmtATPS1蛋白的分子进化树显示,重要的粮食作物水稻、玉米、高粱和谷子中都有类似序列。(2)半定量RT-PCR分析结果显示,OsmtATPS1基因在水稻成熟胚诱导的愈伤组织、两周幼苗期、30天苗期和成熟期等各组织中除幼穗外,在其他组织中均有不同程度的表达。诱导表达谱分析显示,OsmtATPS1基因对不同胁迫处理具有不同响应特征。MeJA、PEG和NaCl等处理均能诱导OsmtATPS1基因在水稻地上部分表达,但高温、IAA和SA处理后OsmtATPS1基因在地上部组织中的表达却受到了抑制;低温和高温处理都能强烈诱导OsmtATPS1基因在地下部组织中的表达,但MV处理能强烈抑制OsmtATPS1基因的表达。(3)分别以PTF486和p35S-eGFP载体构建了OsmtATPS1-GFP融合表达质粒并瞬时转化水稻原生质体、烟草叶片,以及稳定转化水稻愈伤组织。激光共聚焦显微镜观察结果显示OsmtATPS1-GFP融合蛋白在水稻原生质体中以颗粒状分布,其中部分分布于叶绿体上,但还有部分分布位置未知;瞬时转化的烟草叶片中,结果OsmtATPS1-GFP融合蛋白的定位与水稻原生质体中的结果一致。以OsmtATPS1-GFP融合表达质粒稳转水稻愈伤组织,用鉴定表达阳性的抗性愈伤制备原生质体,并用线粒体染料对原生质体进行染色,结果显示OsmtATPS1-GFP融合蛋白在线粒体上表达。上述结果表明OsmtATPS1蛋白同时定位于线粒体和叶绿体两种细胞器中。(4)构建了OsmtATPS1基因的植物表达载体,利用根癌农杆菌介导法将其转化到水稻愈伤组织中,现已获得8株超表达,16株反义RNA和72株RNAi转基因T0代植株。定量RT-PCR分析T0代转基因植株,结果显示在超表达转基因植株中OsmtATPS1表达水平最高上调8倍左右,在RNAi转基因植株中OsmtATPS1的表达水平下调0.1倍左右。表型分析发现RNAi转基因植株的分蘖数目减少,但超表达和反义RNA植株无明显形态异常。另外,本研究还进行了OsmtATPS1基因在拟南芥中异源超表达分析,现已收获到了T2代种子。(5)利用实时定量RT-PCR分析T0代OsmtATPS1转基因植株,结果发现OsmtATPS1基因超表达后NOX2基因表达量上调,但OsmtATPS1基因沉默表达后OsNOX2基因的表达并未明显改变;对水稻ATP合酶其他亚基基因的表达分析发现,OsmtATPS1超表达后RMATP6的表达量稍下调、RMATPδ表达量明显下调、RMATP9和RMATPα的表达量剧烈上调,但OsmtATPS1基因沉默表达后ATP合酶其他亚基基因的表达未明显改变。(6)本研究利用水稻基因组数据库IRGSP查找到OsmtATPS1基因的启动子序列,并扩增到OsmtATPS1基因启动子序列,通过启动子在线分析软件PLANTCARE进行功能预测,构建了OsmtATPS1启动子驱动GUS报告基因表达载体并转化水稻愈伤组织,并获得了阳性转基因愈伤组织。综上所述,本研究通过对OsmtATPS1基因的功能分析可以确定OsmtATPS1蛋白既在叶绿体上表达又在线粒体中表达;其对高低温、MeJA和MV等胁迫处理有响应。通过分析T0代转基因植株发现,OsmtATPS1基因确实与NOX2基因存在着共表达关系,且此基因的表达确实影响了线粒体ATP合酶其他亚基的表达,同时获得了OsmtATPS1::eGFP、超表达和沉默表达等稳转植株,为以后进一步研究其功能奠定了基础。