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结肠癌是临床发病率和死亡率常年高居第三的常见肿瘤,对全人类的健康状态构成了极大的威胁和影响[1]。虽然新的治疗技术及新的靶向药物的不断研发,在一定程度上改善了结肠癌病人的预后,但以5-FU为基础的化疗,仍然是临床上结肠癌病人化疗的一线选择。但有超过一半的5-FU用药患者由于持续使用5-FU化疗后,对5-FU敏感性降低而对5-FU产生了化疗耐药[2,3,4]。因此,阐明5-FU的耐药机制对提高5-FU化疗疗效、改善结肠癌患者预后极为重要。新近研究表明临床上许多化疗所用的治疗药物实现其抗肿瘤疗效是由于激活了肿瘤细胞凋亡信号通路,使其发生凋亡[5]。所以肿瘤细胞凋亡信号通路的抑制及阻断已成为化疗抵抗的原因之一。我们前期实验进一步验证了5-FU是通过激活其P-JNK依赖的Caspase-3的凋亡信号通路对结肠癌CT26细胞发挥杀伤作用[6]。目前,大量研究已证实肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展、侵袭转移及化疗耐药等方面都发挥着重要的作用[7,8,9]。巨噬细胞是肿瘤微环境的重要细胞成分,已有研究证实巨噬细胞对正常细胞的癌变、肿瘤细胞的生长、肿瘤细胞的侵袭外渗及肿瘤组织中的血管新生等多个方面均有至关重要的影响和作用[10,11],但其与化疗耐药的关系研究善少。我们前期体外细胞实验和小鼠体内实验均发现5-FU可诱导巨噬细胞多胺合成增加,多胺进一步可通过抑制了由5-FU激活的P-JNK/caspase-3凋亡信号通路从而引起结肠癌对5-FU产生化疗抵抗[6]。我们的研究以巨噬细胞多胺代谢异常为切入点,解析巨噬细胞在结肠癌5-FU耐药中的作用及机制,研究结果对于从肿瘤微环境角度寻找提高肿瘤细胞对5-FU的敏感性,改善5-FU的抗癌疗效,提高患者生存率的有效策略都有重要的指导意义。目的:探讨巨噬细胞在结肠癌CT26细胞对5-FU产生耐药过程中的作用及机制。方法:1.5-FU可通过激活结肠癌CT26细胞P-JNK/caspase-3凋亡信号通路以发挥其抗癌效应。为了进一步验证细胞凋亡在5-FU发挥抗癌效应中的作用,我们运用细胞凋亡检测及western blot等方法检测结肠癌细胞用或不用5-FU处理下的细胞凋亡情况及凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3、p-jnk的表达。进一步建立结肠癌ct26细胞小鼠移植瘤模型,运用p-jnk特异性抑制剂抑制p-jnk/caspase-3凋亡信号通路后,再观察5-fu疗效,验证该凋亡通路在5-fu发挥抗癌效应中的作用。2.5-fu可诱导巨噬细胞引起结肠癌ct26细胞对5-fu产生耐药。为了进一步研究巨噬细胞在结肠癌ct26细胞5-fu化疗耐药中的作用,我们分别用正常培养基(nm)、巨噬细胞培养上清(cm)及预先用低剂量5fu处理过的巨噬细胞培养上清(cm(5-fu))处理ct-26细胞,并给予5-fu处理,用cck8法检测各组细胞增殖情况、pi/annexin-v流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。然后我们将这一发现在结肠癌ct26细胞小鼠移植瘤模型中进行验证,应用上述条件培养基处理联合5-fu化疗,动态观察移植瘤生长情况。3.5-fu可诱导巨噬细胞通过抑制p-jnk/caspase-3凋亡通路的激活,引起结肠癌细胞对5-fu产生耐药。为了进一步探明5-fu可诱导巨噬细胞引起结肠癌ct26细胞对5-fu产生获得性耐药的机制。我们用分别用nm、cm和cm(5-fu)处理结肠癌ct26细胞,并给予5-fu处理,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况、westernblot检测凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3、p-jnk表达。4.5-fu可诱导巨噬细胞多胺合成分泌增加,多胺可抑制由5-fu激活的p-jnk/caspase-3凋亡通路,从而使结肠癌细胞对5-fu产生耐药。为了研究5-fu处理巨噬细胞后发生何种代谢改变或产生何种代谢产物进而引起结肠癌细胞对5-fu产生获得性耐药。我们将经或不经5-fu处理的巨噬细胞培养上清送做代谢芯片分析,从而找出引起结肠癌细胞对5-fu产生获得性耐药的代谢改变或是代谢产物。然后我们用该代谢产物特异性抑制剂和5-fu共同处理巨噬细胞后收集其培养上清,标记为cm(5-fu+inhibitor)。然后分别用nm、cm(5-fu)和cm(5-fu+inhibitor)处理结肠癌ct26细胞,并给予5-fu处理,westernblot检测凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3、p-jnk表达。然后我们将这一发现在结肠癌ct26细胞小鼠移植瘤模型中进行验证,应用上述条件培养基处理联合5-fu化疗,动态观察移植瘤生长情况。结论:1.通过检测细胞凋亡情况发现5-fu处理组ct26细胞凋亡数目较对照组显著增加,同时westernblot也发现5-fu处理组细胞凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3、p-jnk表达较对照组也显著升高。进一步在结肠癌ct26细胞小鼠移植瘤模型中发现,运用P-JNK特异性抑制剂抑制P-JNK/caspase-3凋亡信号通路后再给予5-FU化疗,其化疗效果明显降低。由此,我们提出5-FU可通过激活结肠癌CT26细胞P-JNK/caspase-3凋亡信号通路以发挥其抗癌效应的结论。2.用CCK8法检测细胞增殖情况发现CM(5-FU)能显著降低结肠癌CT26细胞对5-FU的化疗敏感性,而CM则无此作用。在皮下瘤模型中,我们统计发现CM(5-FU)组用或不用5-FU化疗,肿瘤平均直径的变化量较NM组显著减少,化疗敏感性显著降低,而CM组用或不用5-FU化疗肿瘤平均直径的变化量较NM组则无明显差异。由此,得到了5-FU可诱导巨噬细胞引起结肠癌CT26细胞对5-FU产生获得性耐药的结论。3.通过检测细胞凋亡情况发现,CM(5-FU)显著减少由5-FU诱导的结肠癌CT26细胞的细胞凋亡数目。western blot也发现CM(5-FU)能显著抑制由5-FU有诱导的凋亡相关蛋白P-JNK、caspase-3的表达。因此可以推断,5-FU可诱导巨噬细胞通过抑制P-JNK/caspase-3凋亡通路的激活,引起结肠癌细胞对5-FU产生获得性耐药。4.代谢芯片分析发现,5FU可刺激巨噬细胞发生代谢改变,其中多胺合成代谢的改变可能与结肠癌耐药相关。进一步western blot验证了用多胺合成酶抑制剂(DFMO)可显著减弱CM(5-FU)对由5-FU激活P-JNK/caspase-3凋亡通路的抑制作用,使P-JNK、caspase-3的表达得到回复。在皮下瘤模型中也证实,CM(5-FU+DFMO)组化疗敏感性较CM(5-FU)显著增加。由此可推测5-FU可诱导巨噬细胞多胺合成分泌增加,而多胺可抑制由5-FU引起的P-JNK/caspase-3凋亡通路的激活,从而使结肠癌细胞对5-FU产生获得性耐药。