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背景
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，高发于东南沿海地区。我国每年约有11万人死于肝癌，占全球肝癌死亡数的45﹪。值得注意的是，世界各地原发性肝癌的发病率有上升趋势。根据卫生部统计，我国肝癌年死亡率占肿瘤死亡率的第二位。肝癌的治愈性治疗手段包括手术切除、肝移植、超声消融等。肝癌的姑息性治疗手段包括TACE、化疗、热疗、基因治疗等。手术切除仍是目前原发性肝癌有可能达到根治目的的最好治疗方法。但原发性肝癌发展很快，很多病人就诊时往往已属于中晚期，绝大多数已失去手术机会。而且据国内资料报道，既使是小肝癌的根治切除，术后5年复发率也达43.5﹪。因此寻找一种既有效、可靠、又能降低复发率而且包括能针对中晚期肿瘤患者的治疗方法已是迫在眉睫。近年来热疗和基因治疗的进展很快，已作为肿瘤的综合治疗手段应用于临床。热疗可通过多种途径杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤血管形成，已经应用于临床多种中晚期恶性肿瘤的治疗，但降低其治疗效果的主要原因在于升温后肿瘤细胞的热耐受性，而野生型p53既可降低肿瘤细胞的热耐受性，且其本身亦可促进肿瘤细胞的凋亡，故两者联合应用可能达到一种协同效应。本研究以BALB/c裸鼠为实验对象，采用接种人肝癌细胞的方法，建立荷肝癌裸鼠模型。将其随机分成四组。分别采用局部热疗(局部水浴加热)、瘤内注射野生型p53基因治疗、局部热疗联合瘤内注射野生型p53基因治疗及不做处理作为对照组等四种措施，来检测治疗前后肿瘤的体积变化、瘤体内VEGF蛋白表达及瘤体微血管密度变化，并比较处理后各组移植瘤的病理切片来显示肿瘤坏死情况。通过数据统计，通过观察不同疗法对肿瘤血管生长及肿瘤生长的影响，探索一种安全有效治疗肝癌的新疗法。目的①以BAIB/c裸鼠为实验对象，采用接种肝癌细胞的方法，建立荷肝癌裸鼠模型。并观察动物模型肿瘤的生长情况。
②采用热疗和瘤内注射野生型p53基因治疗两种治疗方法，观察单独治疗及联合治疗后对肿瘤生长的影响及其协同作用。
探讨两者联用的协同作用机制，为对肝癌治疗采用一种新的有效疗法提供可靠的实验依据。
材料与方法
1．体外培养HepG2肝癌细胞解冻HepG2细胞，并将其置于含10﹪新鲜胎牛血清的DMEM液中常规培养并传代。待各培养瓶中HepG2细胞长满后，将其收集并调整细胞密度为5×10<'6>/0.2ml，以备注射。
2．建立皮下荷肝癌裸小鼠模型，观察肿瘤生长情况。
将细胞密度为5×10<'6>/0.2的HepG2细胞悬液注射于裸小鼠后肢背部皮下，每只注射0.2ml，建立皮下荷肝癌裸小鼠模型。每三天用游标卡尺测量注射部位，检测移植瘤的长径、短径，计算肿瘤体积，并绘制肿瘤生长曲线。
3．实验分组
取32只裸鼠随机分成四组：局部热疗组(局部水浴加热)、瘤内注射野生型p53组、局部热疗联合瘤内注射野生型p53组及对照组。并分别根据处理措施给予对应的处理。
4．观察指标
分别观察：①治疗前后各组裸鼠瘤体的体积变化；②瘤体内VEGF阳性细胞百分比；③瘤体微血管密度变化；④观察比较处理后各组移植瘤的病理切片。 5．统计学分析统计软件采用SPSS(Statistical Program for Social Sciences，社会科学统计程序)软件包13.0版。P<0.05认为有统计学意义。
结果
1．局部热疗联合瘤内注射野生型p53基因治疗对移植瘤生长情况的影响根据模型肿瘤生长曲线可以看到，对照组肿瘤体积随瘤龄延长其体积明显增大；热疗组治疗后瘤体有所缩小；基因治疗组瘤体缩小较明显；联合治疗组，瘤体缩小更明显。经治疗后，瘤体生长均受到抑制，但联合治疗组抑制肿瘤体积效果更明显。联合治疗组肿瘤体积与其他三组相比，统计学有显著性差异，P<0.05。
2．各组的移植瘤组织学的比较各治疗组的瘤体HE染色显示，对照组的肿瘤生长良好，细胞分裂相多见，坏死面积较低。其余各组肿瘤出现不同程度的肿瘤坏死，坏死相对面积大于对照组。这种现象以热疗基因联合治疗组最为明显。
3．各组的移植瘤VEGF的表达对各实验组的移植瘤进行VEGF免疫组化分析，结果示：对照组VEGF阳性细胞百分比为51.351±6.909﹪，热疗、基因治疗和联合治疗后VEGF的表达分别为38.776±7.364﹪、34.975±4.234﹪、29.053±3.208﹪。热疗、基因治疗和联合治疗后VEGF的表达均较对照组表达有所降低(P<0.05)。联合治疗组VEGF蛋白表达较热疗组或基因治疗组降低(P<0．05)。而热疗组与基因治疗组VEGF蛋白表达，差异无明显统计学意义(P>0．05)。
4．各组的移植瘤CD34的表达与以及MVD的分析对各实验组的移植瘤进行CD34免疫组化分析，结果示：对照组CD34标记的微血管密度为20.500±3.779，热疗、基因治疗和联合治疗后MVD的表达分别为15.000±2.268、11.625±2.504、6.750±2.121。热疗、基因治疗和联合治疗后CD34蛋白和MVD表达均较对照组表达降低(P<0.05)。联合治疗组CD34蛋白和MVD表达较热疗组或基因治疗组表达降低(P<0.05)。
5．将VEGF与MVD进行直线回归分析后，发现裸鼠移植瘤的VEGF的表达与MVD的表达有关联，它们之间存在正相关性(r=0.749,P<0.001)。
结论
1．热疗和野生型p53基因治疗都能抑制荷肝癌裸鼠转移瘤的生长。
2．热疗抗肿瘤血管生成的作用可抑制肿瘤的生长。
3．热疗的作用机理可能是抑制肿瘤组织VEGF的表达，减少肿瘤组织内血管生成，并使MVD降低，从而达到抑制肿瘤生长的作用。
4．热疗和野生型p53基因联合应用可达到较好的协同作用，比单一治疗能更好的抑制肝癌转移瘤的生长。
5．热疗和野生型p53基因治疗的治疗机制决定了其可用于肝癌等恶性肿瘤的治疗。