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下腰痛是影响患者日常活动及工作能力的常见病,椎间盘退变性疾病被认为是导致其发病的主要原因之一。尽管椎间盘退变的发病机制仍不明确,但目前认为细胞外基质的分解是椎间盘退变过程中重要的使动因素之一,而细胞外基质结构的改变与不良的基因背景,生物力学因素与营养因素等有关。因此在椎间盘退变性疾病的发生发展过程中,是在年龄因素与生物力学负荷的双重作用下形成的细胞外基质的分解,同时不良的基因遗传会使病情加重。骨成型蛋白(Bone-morphogenetic protein,BMPs)是一类生长因子,对椎间盘的细胞外基质发挥促合成代谢与抗分解代谢的作用,以维持细椎间盘细胞代谢平衡稳定。BMP/Smad信号通路通过激活下游的Smad转录因子从而增强细胞外基质的分泌并起到修复椎间盘退变的作用。叉头框C2转录因子(Forkhead box protein C2,Fox C2)是叉头框转录因子家族(FOX)中的一员。研究中发现,Fox C2作为一种转录因子,在诸多生理病理过程中发挥重要的作用,如细胞的增殖、分化以及凋亡过程。在软骨细胞分化的早期阶段Fox C2也可能扮演着重要的角色。用BMPs处理了骨骼前体细胞,当Foxc2表达升高同时可以观察到SOX9、noggin及aggrecan的表达。在骨细胞中,Foxc2是BMP-2的下游目标因子,具有促进骨细胞的存活、增殖以及分化的作用。在一个类似的研究中,当C2C12细胞中表达外源性的Foxc2时,可以引起BMP-4表达的上调。综上所述,Foxc2是BMP信号通路发挥促细胞外基质分泌作用的一个重要元件。BMPs在髓核细胞中扮演着促合成代谢的重要角色,而Foxc2的表达可能在椎间盘退变的发生过程中产生显著的影响。因此证明Foxc2与人退变椎间盘之间的关系,同时研究Fox C2在髓核细胞中是否与细胞增殖及合成代谢相关。尤其是理解Fox C2与BMP信号通路之间的调节分子机制,对了解椎间盘退变的发生过程,发现新的治疗方法具有重要意义。目的FOXC2是头框转录因子这个有着翼状螺旋和DNA结合域的转录因子家族中的一员。近期的研究表明BMP信号通路需求FOXC2的表达,同时FOXC2在信号通路中扮演着调控者的角色。因此我们研究了FOXC2在人退变间盘组织中的表达和FOXC2与髓核细胞增殖的关系。同时进一步探讨Fox C2在髓核细胞中的作用及信号调节的机制,以期深入了解椎间盘退变的机制和发现新的治疗手段。方法1.应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,real-time q RT-PCR)技术检测FOXC2在人椎间盘组织中的表达,同时分析FOXC2的表达量与椎间盘退变程度之间的关系。2.鉴别原代培养的大鼠髓核细胞的细胞表型。通过免疫荧光技术以及real time q RT-PCR技术检测细胞中I型胶原蛋白、II型胶原蛋白以及聚合蛋白聚糖的表达。3.通过CCK-8实验检测了当Fox C2过表达转染后对髓核细胞的增殖能力的影响。通过免疫荧光技术以及real time q RT-PCR技术检测Ki-67,这个细胞增殖能力的标志物,去了解Fox C2对大鼠髓核细胞增殖的影响。通过免疫荧光技术以及real time q RT-PCR技术检测BMP-7对Fox C2表达的调控作用,同时Western blot以实验检测Fox C2在大鼠髓核细胞的表达。4.通过进行Fox C2过表达质粒的转染从而了解Fox C2对BMP-7调节的细胞外基质促进作用的影响。同时通过Smad1基因敲除质粒的转染取研究BMP-7信号通路对Fox C2的调节作用。通过real time q RT-PCR技术检测Fox C2与noggin的关系。同时我们通过检测BMP-7、Fox C2以及noggin同时或不同时存在的情况下细胞外基质如聚合蛋白聚糖、II型胶原蛋白的表达情况。结果1.我们收集的手术摘除退变髓核组织,来自于36位椎间盘退变性疾病患者,其中有19位男性患者及17位女性患者,年龄区间在33-57岁之间。应用Real-time RTPCR检测4例退变髓核组织中FOXC2的m RNA表达水平,以特发性脊柱侧凸患者作为对照,发现退变髓核组织中FOXC2的表达显著增高。不同退变程度的髓核组织内FOXC2的m RNA表达与椎间盘退变的分级相关,且表达水平随着退变程度的加深而提高,而FOXC2表达与性别、退变分型则并没有显著的相关性。2.单层贴壁培养的大鼠髓核细胞呈现圆形或多角形,细胞质中含有细小颗粒。聚合蛋白聚糖、II型胶原蛋白在大鼠髓核细胞中的表达通过免疫荧光技术可以观察到。同时I型胶原蛋白在大鼠髓核细胞和大鼠髓核组织比大鼠纤维环组织中的表达要明显降低。而II型胶原蛋白的表达相对于大鼠纤维环组织在鼠髓核细胞和大鼠髓核组织中的表达水平更高。3.应用CCK-8、免疫荧光技术以及real time q RT-PCR技术检测Fox C2对髓核细胞的增殖的影响。首先用慢病毒载体转染了Fox C2基因进入髓核细胞内进行表达同时也转染Lenti-GFP作为对照。免疫荧光的结果显示,转染了Lenti-Fox C2的髓核细胞中Ki-67的表达明显增强了。其次,我们发现在髓核细胞中转染Lenti-Fox C2对Ki-67的m RNA表达的上调作用有明确的时间相关性,48或72小时后Ki-67的m RNA表达显著高于对照组。最后通过CCK-8增殖实验检测了转染了Lenti-Fox C2、Lenti-GFP及未处理对照组后的髓核细胞增殖。与对照组相比Lenti-Fox C2转染显著的促进了髓核细胞的增殖。4.我们研究了BMP-7在大鼠髓核细胞中是否可以诱导Fox C2表达。免疫荧光实验得到了确认的结果,以50ng/ml或100ng/ml的BMP-7处理髓核细胞2小时后Fox C2蛋白的表达明显升高。与对照组或者低浓度组对比后发现,高浓度的BMP-7对Fox C2的上调作用更明显。因此我们分别按时间梯度及浓度梯度向培养基中加入BMP-7,而后检测到Fox C2表达的水平受到BMP-7浓度与处理时间的影响。同时我们通过Western blots实验发现,以100ng/ml浓度的BMP-7处理髓核细胞60分钟后可以达到最好的上调Fox C2表达的效果。此外,我们发现过表达Fox C2在髓核细胞内可以明显的诱导samd1/5/8的磷酸化,也说明Fox C2激活了BMPs通路。同时Fox C2的过表达抑制了noggin的表达,这也可以起到上调BMP-7的作用。5.通过real-time q PCR技术检测了Fox C2、BMP-7对细胞外基质基因表达的调控。与对照组相比单纯在髓核细胞中表达Fox C2或单纯用BMP-7刺激髓核细胞都能使II型胶原蛋白及聚合蛋白聚糖的表达升高,但两者同时存在时对细胞外基质的上调作用显著增强。与我们假设一致的是当BMP信号通路被Si RNA-Smad1抑制时,会导致Fox C2对于髓核细胞的促合成代谢调节作用相对于单纯BMP-7作用于髓核细胞时减弱。总结1.我们发现FOXC2在人类退变间盘中表达,且FOXC2的m RNA表达水平与椎间盘退变的程度正相2.我们发现Fox C2对大鼠髓核细胞的增殖具有促进作用。3.更重要的是,我们发现了BMP-7能够促进Foxc2表达,而Foxc2能够对信号通路产生维持通路激活的正反馈作用。4.我们的结果说明过表达Fox C2能够在大鼠髓核细胞显著的增加促合成代谢作用。进一步研究的重点在于明确Fox C2在其他信号通路中扮演的角色以及信号通路之间的交互作用。