目的:通过建立导致HEK293细胞脱离培养时完全“失巢”的培养模型,首先通过包括电镜观察、TUNEL染色、流式检测、Hoechst33342-PI双染色等多种方法研究HEK293细胞在失巢培养条件下发生的凋亡现象;并经过悬浮和贴壁培养的多轮循环,获得一种具有悬浮适应-可贴壁特性、并且能够抵御失巢凋亡的HEK293ar亚群,进而通过多种方法对该细胞亚群的失巢凋亡抗性特性进行研究,并研究该亚群是否是通过建立细胞间连接形成细胞团进而赋予细胞失巢凋亡的抗性。其次,基于失巢凋亡抗性亚群具有的失巢凋亡抗性而以细胞团形式生存和可贴壁培养的双重特点,对其可能在建立新型瞬时转染系统生产蛋白的可行性和无载体固定化细胞团培养的增殖特性进行研究。再次,以在失巢条件下可形成细胞团而生存的失巢凋亡抗性亚群HEK293ar和失巢敏感的亲本细胞HEK293这一对自然细胞模型研究HAb18G/CD147黏附分子在失巢凋亡抗性细胞中的表达差异,并研究其调节细胞间连接的作用,进而明确HAb18G/CD147调节的细胞间连接在失巢凋亡抗性调节中的作用;同时还研究另外一种黏附分子E-cadherin是否也参与细胞失巢凋亡抗性的调节,并研究这两个黏附分子在失巢凋亡抗性调节中的可能相互联系,进而研究HAb18G/CD147调节的细胞连接在抑制失巢凋亡信号调节通路中的作用和信号调节网络。最后,基于失巢条件下,细胞形态和骨架发生的显著变化,研究失巢敏感HEK293细胞和抗性亚群HEK293ar细胞在失巢条件下主要骨架蛋白的重排方式的差异,并研究HAb18G/CD147和骨架蛋白组织分子plectin之间可能的相互作用,进而研究HAb18G/CD147是否通过plectin而调节骨架重排的可能性。方法:根据研究目的,实验内容共分为四个部分,实验操作方法简述如下。1哺乳动物工程细胞可贴壁失巢凋亡抗性亚群(HEK293ar)的获得建立完全失巢培养模型的培养条件,通过电镜观察等研究该细胞在失巢条件下由于发生失巢凋亡而死亡的时间规律;通过有限稀释法获得HEK293的单细胞克隆株,分别研究其在失巢条件下的失巢凋亡敏感情况;研究细胞失巢模型培养和细胞贴壁培养长时间循环培养对单克隆细胞群失巢凋亡抗性的影响,进而通过细胞失巢培养和贴壁培养的多轮循环以获得具有失巢凋亡抗性的可贴壁细胞亚群;长时间失巢培养观察失巢凋亡抗性亚群的细胞形态变化,以及不同时间取样检测其发生的失巢凋亡,以验证其具有失巢凋亡抗性的特性是否稳定存在;直接将失巢培养的细胞群在贴壁条件下培养,观察细胞是否还具有重新贴壁培养的特性。最终以获得一种具有以建立细胞间连接而成团具有失巢凋亡抗性的可贴壁性细胞亚群。2、抗性细胞亚群HEK293ar细胞在瞬时转染法生产蛋白和无载体固定化方面的应用研究通过Lipofectin2000试剂分别在失巢敏感细胞HEK293和抗性细胞HEK293ar中高效转染pEGFP/N1,悬浮培养研究其在悬浮培养条件下生产蛋白的差异;通过Lipofectin2000试剂在抗性细胞HEK293ar中转染pEGFP/N1,连续悬浮培养并每天取样研究其在悬浮条件下生产蛋白效率的变化。重要的,通过建立高效聚乙烯亚胺转(PEI)染技术,建立基于HEK293ar细胞亚群的高效PEI瞬时转染技术策略。3、HAb18G/CD147黏附分子参与调节细胞连接和失巢凋亡抗性的研究以获得的失巢凋亡抗性亚群HEK293ar和亲本细胞HEK293这对细胞为模型,通过流式细胞术测定和western blot等方法研究HAb18G/CD147黏附分子的表达差异,并研究其在悬浮培养抗性细胞时形成的细胞团中的亚细胞定位;通过RNAi技术下调HAb18G/CD147表达研究其对细胞间连接和细胞凋亡抗性的影响;研究参与调节细胞间连接和凋亡抗性的另外一种黏附分子E-cadherin在这对细胞间的表达差异,并通过RNAi技术研究下调此蛋白表达对细胞间连接和细胞存活的影响;通过western blot和免疫荧光法研究下调HAb18G/CD147对E-cadherin表达和细胞生存的影响;通过额外添加EDTA和抗-E-cadherin抗体阻断细胞间连接研究封闭或破坏E-cadherin作用对细胞表达HAb18G/CD147的影响,并通过RNAi技术下调E-cadherin表达研究其对HAb18G/CD147表达的影响。通过研究添加LY294002(PI-3K通路信号竞争性抑制剂)和PD98059(ERK通路抑制剂)等信号通路抑制剂对失巢凋亡抗性亚群细胞增殖和细胞间连接的影响,研究其参与失巢凋亡抗性调节的细胞主要信号通路。4、失巢凋亡抗性亚群在失巢培养下的细胞骨架特征和黏附分子HAb18G/CD147之间的关系研究通过形态观察研究抗性细胞亚群HEK293ar细胞在失巢条件的细胞连接和细胞成团现象;研究抗性细胞在失巢前后的微纤维丝细胞骨架的特征;通过免疫荧光法研究HEK293ar细胞在失巢培养下actin (G-或F-)、α-tubulin和plectin的骨架重排特征以及HAb18G/CD147的亚细胞定位;采用RNAi干涉HAb18G/CD147表达研究其对F-actin骨架重排的可能影响;通过免疫荧光法研究失巢凋亡时HAb18G/CD147和plectin参与失巢凋亡调节的现象;通过免疫荧光双标记法研究HAb18G/CD147和plectin在失巢培养抗性亚群时的相互作用,通过RNAi下调HAb18G/CD147研究其对失巢培养时这两个分子相互作用的可能影响。结果:1、成功建立了针对失巢培养HEK293细胞的“完全失巢”模型,并成功用于研究工程细胞HEK293在悬浮条件下发生的失巢凋亡。观察到HEK293细胞在失巢条件下发生染色体断裂、膜发泡、DNA断裂、凋亡小体形成和亚二倍体峰等典型的细胞凋亡现象。得到八株HEK293细胞单克隆细胞,研究得知,亲本细胞是由一群有不同失巢敏感程度的细胞亚群而组成的。长时间失巢培养有助于提高细胞的抗失巢凋亡能力。通过利用细胞失巢培养和贴壁培养循环获得了一种具有失巢凋亡抗性以细胞团方式生长的可贴壁细胞亚群。该亚群具有稳定的失巢凋亡抗性和重新贴壁培养的的特性。2、贴壁转染EGFP基因后,抗性细胞HEK293ar在悬浮条件下培养到第三天时仍然维持着高效生产蛋白的能力,而亲本细胞HEK293则由于发生失巢凋亡蛋白产率和HEK293ar相比有明显下降。长时间悬浮培养HEK293ar时,可以维持初始时的高效生产蛋白的能力。利用HEK293ar细胞进行无载体固定化培养时,维持细胞活性在80-87 %,比生长速率达到0.05-0.06 hr-1,此细胞亚群可以用于无载体固定化培养。建立了基于HEK293ar细胞亚群的高效PEI转染策略,其转染效率高达65-75 %,而且在悬浮状态时可以维持高效生产蛋白的能力。3、利用失巢凋亡抗性细胞HEK293ar和HEK293细胞这对自然细胞研究模型,证实黏附分子HAb18G/CD147内源性表达水平的提高是抗性细胞具有失巢凋亡抗性的重要原因。下调HAb18G/CD147可以导致细胞失巢培养条件下细胞间连接断裂以及细胞发生失巢凋亡。成功利用此模型研究证实E-cadherin黏附分子也参与了抗性细胞的抗性调节。下调HAb18G/CD147可以导致E-cadherin在24 hr后逐步降解,细胞间连接断裂。利用EDTA溶液以及抗E-cadherin抗体阻断细胞间连接对HAb18G/CD147表达没有显著影响,干涉E-cadherin也对HAb18G/CD147表达没有明显影响。用PI-3K通路信号竞争性抑制剂LY294002处理抗性细胞对抗性细胞的增殖和细胞间连接有影响,而用ERK通路抑制剂PD98059处理却没有同样的效果。4、阐明了HEK293ar在失巢培养条件下细胞间连接加强和微纤维丝骨架重排的现象;抗性细胞亚群HEK293ar骨架重排在失巢条件下和贴壁下相比呈现紊乱的F-actin排布形式( aberrant cytoskeleton distribution );通过免疫荧光法研究得知,HEK293ar细胞在失巢下细胞骨架蛋白actin、α-tubulin和plectin均呈现紊乱的重排形式,而且和亲本细胞相比,其表达均有所上调。下调HAb18G/CD147导致抗性细胞HEK293ar失巢条件下的F-actin发生重排,表达变弱,呈现典型的细胞发生凋亡时的骨架重排现象,在细胞边缘以及表面突起处部分表达变强;发现抗性细胞亚群在失巢培养时,plectin和HAb18G/CD147的表达存在部分共定位,两分子在抗性细胞中的表达呈正相关(0<Pearson’s correlation<1),通过信号的交迭真实的反映分子表达共定位的程度的参数“Mander’s overlap”接近于1;干涉HAb18G/ CD147后发现,两分子在细胞内的共定位率有明显减少,“Mander’s overlap”系数减少,说明其共定位程度减少。Plectin和HAb18G/CD147分子在细胞发生失巢凋亡时参与了凋亡小体的形成。结论:1、成功获得具有失巢凋亡抗性的贴壁性HEK293ar细胞亚群,以用做研究细胞间连接和工程细胞团生长时的细胞模型,此细胞亚群的获得为建立高效便宜的瞬时转染系统奠定了细胞基础,也是进行无载体固定化培养的适宜细胞亚群。2、成功建立了基于抗性细胞亚群HEK293ar的双阶段瞬时高效转染生产药物蛋白策略,证明了此细胞亚群适宜于用于建立高效转染细胞生产蛋白平台,并且也适宜作为一种重要的无载体固定化培养的细胞亚群。3、利用此模型细胞研究了HAb18G/CD147黏附分子调节的细胞间连接抑制失巢凋亡抗性的信号通路,得出结论为:HAb18G/CD147调节的细胞连接是以E-cadherin-PI-3K依赖的信号通路调节失巢凋亡抑制的。4、利用此模型研究了失巢抗性细胞在失巢下的细胞骨架重排特征,证实了失巢凋亡抗性细胞在失巢下过表达骨架蛋白的特性;HAb18G/CD147可能是通过骨架蛋白的组织者plectin调节细胞骨架的重排。