近年来，2型糖尿病的患病率有急剧增加的趋势，据估计到2025年，患糖尿病的人数将超过3亿。胰岛素抵抗是肥胖和2型糖尿病早期重要的发病机制，已经成为重要公众健康问题。胰岛素抵抗状态下存在糖类和脂肪代谢效率降低。线粒体是机体能量代谢和供给的核心细胞器，在代谢性疾病中的作用不容忽视。已有研究表明线粒体功能障碍与胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生密切相关，可能是胰岛素抵抗的发生机制之一。线粒体功能异常包括氧化能力的降低及ATP合成的减少，可导致脂质沉积，引起胰岛素抵抗。线粒体形态结构的维持在调节能量代谢中发挥重要作用。线粒体是一种动态的细胞器，通过不断的融合和断裂过程来维持其网状结构及功能。线粒体融合蛋白（mitofusin，Mfn）促进线粒体融合，调节线粒体生物合成及网状结构的维持。而Mfn2是哺乳动物细胞中介导线粒体融合的关键蛋白之一。体内和体外实验模型表明生理或病理状态可导致Mfn2表达的改变，如糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗下调Mfn2表达，而运动和体重减轻则上调Mfn2表达。有研究报道，下调Mfn2表达使线粒体膜电位降低、氧耗及葡萄糖氧化能力降低，而上调Mfn2表达使线粒体膜电位增加，氧耗及葡萄糖氧化能力增强。先前研究表明高脂饮食下调了胰岛素抵抗大鼠骨骼肌Mfn2表达。越来越多的研究表明Mfn2表达与胰岛素抵抗状态相关，但具体机制仍不清楚。本课题通过高脂饮食喂养大鼠建立胰岛素抵抗模型，同时用饱和脂肪酸孵育HepG2细胞建立胰岛素抵抗细胞模型，采用重组腺病毒介导的基因转染方法上调Mfn2表达，研究Mfn2对胰岛素抵抗大鼠肝脏糖、脂代谢的的影响，分别在动物和细胞水平探讨其改善胰岛素抵抗的具体分子机制。本实验内容主要包括以下四部分：第一部分高脂诱导胰岛素抵抗发生及对肝脏Mfn2表达的影响目的：建立高脂诱导的胰岛素抵抗动物模型，观察高脂对大鼠肝脏Mfn2表达的影响。方法：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠84只，体重60-80g，适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（normal diet, ND）12只和高脂组（high-fat diet, HFD）72只。ND组给予基础饲料，热量组成为脂肪10.3%，碳水化合物65.5%，蛋白质24.2%，总热量为348kcal/100g；HFD组给予高脂饲料，其热量组成为：脂肪59.8%，碳水化合物20.1%，蛋白质20.1%，总热量为501kcal/100g。所有动物自由摄食饮水，明暗周期为12h（6am-6pm），室温20℃-23℃。实验第8周末，两组分别随机选出6只进行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹（hyperinsulinaemic euglycaemic clamp）实验，计算葡萄糖输注率（glucose infusion rate，GIR），评价胰岛素敏感性。判断造模成功后，处死大鼠，留取血清及肝组织进行相关指标检测。血糖（blood glucose，BG）应用快速血糖仪测定。血浆胰岛素（insulin，INS）、游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）检测采用ELISA试剂盒测定。血甘油三酯（triglyceride，TG）及总胆固醇（total cholesterin，TC）用全自动生化分析仪测定。肝组织Mfn2mRNA及蛋白水平分别采用Real time PCR及Western blot方法检测。结果：1两组大鼠一般指标的比较各组大鼠体重随时间延长而增加，HFD组大鼠体重（357.0±32.5g）与ND组（355.7±39.0g）相比，差异无统计学意义（P>0.05）。HFD组FBG水平（5.72±0.43mmol/L）高于ND组（5.21±0.38mmol/L），差异有统计学意义（P<0.05）。HFD组INS水平（37.59±7.02mU/L）高于ND组（27.24±4.68mU/L），差异有统计学意义（P<0.05）。HFD组血TG水平（0.32±0.09mmol/L）高于ND组（0.24±0.05mmol/L）；HFD组血TC水平（1.42±0.17mmol/L）较ND组（1.16±0.15mmol/L）高，差异有统计学意义（P<0.05）。HFD组血FFA水平（0.80±0.12mol/L）较ND组（0.60±0.08mol/L）高，差异有统计学意义（P<0.01）。2两组大鼠葡萄糖输注率的比较HFD组GIR（13.66±2.54mg/（kg·min））较ND组（28.14±5.00mg/（kg·min））显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。3两组大鼠肝脏Mfn2mRNA及蛋白水平的比较HFD组大鼠肝脏Mfn2mRNA表达水平（0.23±0.04）较ND组（0.91±0.14）降低，差异有统计学意义（P<0.01）。HFD组Mfn2蛋白含量（0.28±0.05）较ND组（0.87±0.07）低，差异有统计学意义（P<0.01）。4肝组织形态学的比较光镜下观察：ND组肝组织结构完整，肝小叶规则，肝细胞排列整齐，在中央静脉周围呈放射状分布，肝细胞中央有大而圆的核，细胞质均匀，未见脂滴和炎症细胞侵润；HFD组大鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞肿胀，肝细胞胞浆内可见大量脂滴空泡，以中央静脉周围最为明显，重者胞质疏松呈网状改变，且可见小叶内及汇管区炎症细胞侵润。透射电镜观察：ND组肝细胞中细胞器结构完好，线粒体、粗面内质网丰富，胞浆内无脂滴及脱颗粒现象，线粒体膜、嵴结构完整，排列规则，粗面内质网排列整齐；HFD组肝细胞内可见大量大小不等的脂滴分布，线粒体有一定程度的肿胀，内外膜部分融合，线粒体嵴变少变短，部分或全部消失，甚至出现空泡化。结论：1高脂饮食诱导大鼠产生胰岛素抵抗，具有高血糖、高胰岛素血症、高脂血症等特点。2高脂饮食导致大鼠肝细胞脂肪变性及线粒体超微结构的异常。3高脂诱导的胰岛素抵抗大鼠肝脏Mfn2表达降低，Mfn2与胰岛素抵抗的发生相关。第二部分Mfn2对胰岛素抵抗大鼠肝脏GK、PEPCK活性的影响目的：观察腺病毒介导的Mfn2转染对胰岛素抵抗大鼠糖代谢相关酶葡萄糖激酶（glucoskinase, GK）及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoen-olpyruvate carboxykinase, PEPCK）的活性影响。方法：实验8周末判断胰岛素抵抗大鼠模型建立成功后，将高脂组剩余60只大鼠随机分为5组，分别为：高脂对照组（Con）12只、空载体对照组（emptyAd adenovirus, Ad）12只、Ad-Mfn2低剂量组（1×10⁸v.p/kg）12只、Ad-Mfn2中剂量组（1×10⁸v.p/kg）12只、Ad-Mfn2高剂量组(1×10¹⁰v.p/kg)12只。以鼠尾静脉注射的方式，Con组给予磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液），Ad组给予空载体（1×10⁸v.p/kg体重），Ad-Mfn2低中高剂量组分别给予相应剂量Mfn2的重组腺病毒。每周1次，连续3周。给予腺病毒干预3周后，进行清醒状态下高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验，计算GIR，处死动物并留取血清及肝组织进行相关指标检测。血糖、血胰岛素及游离脂肪酸测定方法同第一部分。肝脏糖原含量采用肝糖原试剂盒测定。肝GK及PEPCK活性采用酶偶联比色法测定。结果:1给予Mfn2重组腺病毒干预3周后，各组大鼠肝脏Mfn2mRNA及蛋白表达的比较随着Ad-Mfn2剂量增加，大鼠肝脏Mfn2mRNA及蛋白表达水平升高，与Ad组相比差异有统计学意义（P<0.01）。2给予Mfn2重组腺病毒干预3周后，各组一般指标的比较随时间延长各组大鼠体重均增加，但差异无统计学意义（P>0.05）。大鼠FBG、INS随着Ad-Mfn2剂量增加而降低，而GIR升高，与Ad组相比差异有统计学意义（P<0.05）。3各组肝脏糖原含量的比较8周末：HFD组肝糖原含量（4.29±0.45mg/g）较ND组（5.31±0.63mg/g）低，差异有统计学意义（P<0.05）。给予Mfn2重组腺病毒干预3周后：肝糖原含量随着Ad-Mfn2剂量增加而升高，Ad-Mfn2中、高剂量组肝糖原含量与Ad组相比差异有统计学意义（P<0.05）。4各组大鼠肝脏GK、PEPCK活性的比较8周末：HFD组肝脏GK活性（7.70±1.41mIU/（min·mg protein））较ND组（13.87±1.72mIU/（min·mg protein））低，差异有统计学意义（P<0.01）；而PEPCK活性（18.40±2.20mIU/（min·mg protein））较ND组（10.67±2.50mIU/（min·mg protein））高，差异有统计学意义（P<0.01）。给予Mfn2重组腺病毒干预3周后：与Ad组相比，肝GK活性随着Ad-Mfn2剂量的增加而升高，PEPCK活性随着Ad-Mfn2剂量的增加降低，差异有统计学意义（P<0.05）。5给予Mfn2重组腺病毒干预3周后，大鼠肝脏形态学及超微结构的改变光镜下观察：Ad组可见肝小叶结构明显紊乱，肝细胞索消失，肝细胞变大，肝细胞胞浆内可见大量圆形脂滴空泡，核居边，且小叶内炎细胞侵润程度增加。Ad-Mfn2不同剂量组可见肝细胞体积较高脂组变小，胞浆内脂滴减少。透射电镜观察：Ad组肝细胞胞浆中可见大量脂滴，肝细胞核不规整，线粒体膜模糊不清，部分膜破裂，线粒体嵴几乎消失不见，偶有少量残存，有空泡样变；Ad-Mfn2不同剂量组肝细胞胞浆中脂滴较高脂组数量少，线粒体肿胀减轻，内外膜部分融合，线粒体嵴部分或大部分消失。结论：1高脂饮食可导致大鼠血糖水平升高，肝糖原含量减少，糖酵解及氧化关键酶GK活性降低、糖异生关键酶PEPCK活性增加，引起糖代谢异常。2上调Mfn2表达，胰岛素抵抗大鼠肝糖原含量升高，GK活性增加、PEPCK活性降低，并且使肝细胞脂肪变性和线粒体超微结构损伤减轻。Mfn2改善胰岛素抵抗可能与调节GK、PEPCK活性及影响线粒体形态结构有关。第三部分Mfn2对胰岛素抵抗大鼠肝脏ACCα、CPT-Ⅰα表达的影响目的:观察腺病毒介导的Mfn2转染对胰岛素抵抗大鼠脂代谢相关酶乙酰辅酶A羧化酶α（acetyl CoA carboxylase α, ACCα）、肉毒碱棕榈酰转移酶-Ⅰα（carnitine palmitoyltransferase-Ⅰ, CPT-Ⅰα）表达的影响。方法：动物分组及处理同第一、二部分。肝脏TG含量按试剂盒说明测定，Real time PCR测定肝组织ACCα、CPT-Ⅰα mRNA水平，Western blot方法检测ACCα、CPT-Ⅰα蛋白水平。结果：1给予Mfn2重组腺病毒干预3周后，各组大鼠血液一般指标的比较血TG、TC及FFA水平随着Ad-Mfn2剂量的增加而降低，Ad-Mfn2中、高剂量组TC、 FFA水平低于Ad组，差异有统计学意义（P<0.05）；Ad-Mfn2高剂量组TG水平低于Ad组，差异有统计学意义（P<0.05）。2各组大鼠肝脏TG含量的比较8周末：HFD组肝脏TG含量（595.35±159.24μmol/L）高于ND组（371.75±105.47μmol/L），差异有统计学意义（P<0.05）。Mfn2重组腺病毒干预3周后：肝脏TG含量随着Ad-Mfn2剂量的增加而降低，与Ad组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。3各组大鼠肝脏CPT-Ⅰα和ACCα mRNA及蛋白水平的比较8周末：HFD组肝脏CPT-Ⅰα mRNA表达及蛋白水平较ND组低，差异有统计学意义（P<0.05）。HFD组ACCα mRNA水平较ND组高，但蛋白磷酸化水平低于ND组，差异有统计学意义（P<0.05）。Mfn2重组腺病毒干预3周后：CPT-Ⅰα mRNA及蛋白表达随Ad-Mfn2剂量的增加而升高，与Ad组相比，以中、高剂量组明显，差异有统计学意义（P<0.05）。与Ad组相比，ACCα mRNA水平随着Ad-Mfn2剂量的增加而降低，而蛋白磷酸化水平则升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1高脂饮食可导致肝脏脂质沉积，脂肪酸氧化关键酶CPT-Ⅰα表达降低，脂肪酸合成关键酶ACCα磷酸化水平降低。2上调Mfn2表达，胰岛素抵抗大鼠血脂降低，肝脏脂质沉积减轻，脂代谢相关酶CPT-Ⅰα表达升高，ACCα磷酸化水平升高。Mfn2改善胰岛素抵抗可能与CPT-Ⅰα表达升高及ACCα活性降低，改善脂代谢异常有关。第四部分Mfn2改善胰岛素抵抗的机制研究目的：测定胰岛素抵抗大鼠肝脏及HepG2细胞胰岛素信号通路磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinase B, PKB/AKT）途径相关分子的表达，探讨Mfn2改善胰岛素抵抗的具体作用机制。方法：胰岛素抵抗大鼠模型及动物实验同第一、二部分。细胞培养：分别用含0.25mmol/L软脂酸（palmitate，PA）培养基和普通培养基（normalcontrol， NC）培养HepG2细胞24小时后采用葡糖糖氧化酶法测定细胞培养液的葡糖糖含量。判断胰岛素抵抗模型建立成功后，设立软脂酸对照组（Con）、软脂酸空载体组（Ad）、Ad-Mfn2低剂量组（50pfu/cell，Mfn2L）、Ad-Mfn2高剂量组（100pfu/cell, Mfn2H）。Con组给予PBS缓冲液，Ad组按50pfu/cell空载体给予，Ad-Mfn2低剂量组按50pfu/cell给予Ad-Mfn2，Ad-Mfn2高剂量组按100pfu/cell给予Ad-Mfn2。培养24h后，测定各组细胞培养基葡萄糖含量，并采用Real time PCR、Western blot方法分别检测各组Mfn2、INSR、IRS2、PI3K、AKT2、GLUT2mRNA及蛋白水平表达变化。结果：1HepG2细胞的胰岛素抵抗体外模型建立PA组葡萄糖含量（12.16±0.54mmol/（L·mg protein））较Con组（16.02±0.73mmol/（L·mg protein））高，差异有统计学意义（P<0.01），表明用软脂酸诱导胰岛素抵抗体外细胞模型成功建立。2HepG2胰岛素抵抗细胞Mfn2及胰岛素信号通路相关分子的表达PA组Mfn2mRNA水平（0.48±0.11）较Con组（0.97±0.03）低，差异有统计学意义（P<0.01）。PA组Mfn2的蛋白表达量（0.46±0.06）较Con组（0.90±0.11）低，差异有统计学意义（P<0.01）。PA组INSR、IRS2、GLUT2mRNA及蛋白表达较Con组低，差异有统计学意义（P<0.05）。PA组PI3K、AKT2mRNA及总蛋白水平与Con组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。但是PI3K和AKT2蛋白磷酸化水平较Con组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。3MTT法检测Ad、Ad-Mfn2对HepG2细胞增殖的影响，Ad组、Mfn2低剂量及高剂量组细胞增殖率无明显差别。4Mfn2重组腺病毒干预后各组HepG2细胞胰岛素敏感性的比较Mfn2L组及Mfn2H组细胞培养液葡萄糖含量较Ad组降低（P<0.01）。5Mfn2重组腺病毒干预后各组细胞Mfn2及胰岛素信号通路相关分子的表达Mfn2L组及Mfn2H组HepG2细胞Mfn2表达较Ad组显著增加（P<0.01），INSR、IRS2、GLUT2mRNA水平及蛋白表达量较Ad组高，差异有统计学意义（P<0.05）。与Ad组相比，PI3K、AKT2mRNA表达水平及总蛋白表达量变化不显著（P>0.05），但其蛋白磷酸化水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。6大鼠肝脏INSR、IRS2、PI3K、AKT2、GLUT2mRNA水平及蛋白表达的比较实验8周末，HFD组大鼠肝脏INSR、IRS2、GLUT2mRNA表达水平较ND组低，差异有统计学意义（P<0.05）。PI3K、AKT2mRNA及总蛋白水平与ND组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。但PI3K和AKT2蛋白磷酸化水平较ND组显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），见Fig.5。Mfn2重组腺病毒干预3周后，转染Ad-Mfn2的胰岛素抵抗大鼠肝脏INSR、IRS2、GLUT2mRNA及蛋白表达水平较Ad组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。PI3K和AKT2蛋白磷酸化水平较Ad组升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1高浓度游离脂肪酸可诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗，伴随Mfn2表达降低，胰岛素信号通路相关的INSR、IRS2、GLUT2表达降低，PI3K、AKT2蛋白磷酸化水平下降。2高脂诱导大鼠肝胰岛素信号通路相关分子INSR、IRS2、GLUT2表达下降，PI3K、AKT2蛋白磷酸化水平下降。3上调Mfn2表达，胰岛素抵抗大鼠肝脏及HepG2细胞胰岛素信号通路相关分子INSR、IRS2、GLUT2表达升高及PI3K、AKT2蛋白磷酸化水平升高，说明Mfn2通过调节胰岛素信号传导通路相关分子表达改善胰岛素抵抗。