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研究目的乙醇是世界范围内消费最广泛的物质之一,在常见的20种毒品危害中位居第五位,扭转乙醇相关的损害是公共健康的一个紧迫问题。脑星形胶质细胞是继血管内皮细胞后受乙醇及其毒性影响的第一细胞屏障,人类长期乙醇暴露会导致树突和星形胶质细胞不可逆性损伤,而神经元胞体和大部分轴突未见不可逆性损伤,提示树突及星形胶质细胞的远端突起可能是乙醇毒性损伤的关键靶位。由于胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)含量呈短期乙醇暴露时增加而长期暴露则减少的规律性应答,且慢性乙醇处理的大鼠星形胶质细胞的细胞表面更趋于光滑,而当结构性需求强加于ASTs时GFAP不可或缺,由此推测GFAP与肌动蛋白网络调控存在必然的关联,但目前对GFAP切入肌动蛋白调控通路的机制目前还知之甚少。结合本组前期对突触后神经元及T细胞中Plk2-SPAR-肌动蛋白通路的理解,本文在研究不同浓度乙醇暴露对大鼠原代星形胶质细胞活性影响的基础上,探讨了星形胶质细胞GFAP变化与Plk2、SPAR表达间的联系,明确Plk2-SPAR-GFAP途径有助于深入理解乙醇毒性损伤的关键细胞靶位,有助于发展靶向胶质突起和树突可塑性的有效干预措施,这将有望恢复乙醇依赖患者的认知能力,为乙醇依赖患者终止乙醇滥用提供明确的希望和动力。实验方法体外培养新生大鼠原代大脑皮质星形胶质细胞,采用GFAP免疫荧光染色法鉴定细胞纯度后,用MTT法检测不同浓度乙醇暴露对星形胶质细胞活性的影响:用终浓度为0mM、50mM、100mM、200mM、400mM、600mM、800mM的乙醇培养液分别处理2×104/孔的星形胶质细胞24h、48h、72h。通过免疫荧光染色法观察不同浓度乙醇暴露对GFAP表达的影响。应用Real-time PCR从核酸水平检测中间丝GFAP和Plk2及SPAR mRNA的表的水平。实验结果1.新生大鼠原代大脑皮质星形胶质细胞的纯度鉴定达95±1.64%2.不同浓度乙醇对星形胶质细胞活性的影响在乙醇处理24h的情况下,新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的活性变化与正常组比较,50mM与800mM乙醇处理组有差异性。在乙醇处理48h的情况下,与正常组比较,400mM、600mM与800mM乙醇处理组着差异性(P <0.05),而且600mM、800mM组呈显著性差异(P <0.01)。在乙醇处理72h的情况下,与正常组比较,400mM、600mM与800mM乙醇处理组有着差异性(P <0.05),而且400mM、800mM组呈显著性差异(P <0.01)。总体上,乙醇对于星形胶质细胞活性的影响存在先上升(活性增强)后下降(活性减弱)的趋势。3.不同浓度乙醇对星形胶质细胞Plk2、SPAR及GFAP mRNA表达的影响在200mM乙醇处理的情况下, Plk2mRNA在10min时就较对照组明显表达增多(P <0.05),30min时的量达高峰(P <0.01),随后依时间的推移,Plk2mRNA表达呈时间依赖性的减少,在6h时与对照组已未见差异;SPAR在200mM乙醇作用mRNA的表达处于低谷,随着时间的进程, SPARmRNA的量开始回升,48h时,SPAR mRNA表达增加至对照水平;在200mM乙醇作用下, GFAP mRNA的表达渐渐升高,但直至24h时才较对照组明显升高(P﹤0.01),48h表达进一步增加,72h时表达与48h相似,维持于高水平。结论1.以不同乙醇浓度为刺激强度,不同暴露时间为刺激持续时间,当刺激持续时间恒定时,星形胶质细胞对不同浓度的乙醇刺激均产生应答,但应答(细胞活性和GFAP)表达呈二阶段效应,即星形胶质细胞对乙醇暴露具有一定的抗性,超过一定限度,抗性消失。2.星形胶质细胞Plk2-SPAR途径对200mM乙醇暴露存在时间依从性应答改变。3.200mM乙醇暴露的星形胶质细胞GFAP mRNA表达事件出现在Plk2-SPAR事件之后。