目的:近期研究发现早期妊娠时阴道环境微生态失衡会导致早产等不良妊娠结局,但早期妊娠时阴道菌群结构和自然流产、输卵管妊娠等早期妊娠结局之间的关系仍不明。目前,早期自然流产、输卵管妊娠的发病机制尚未研究透彻,但与微生物感染有关。中医对早期妊娠病有独特的见解与认识,辨证分虚、实。与此同时,不同的中医证型在舌苔、肠道等部位存在菌群结构差异已被证实,但尚缺乏关于阴道菌群结构和中医证型的相关研究。本文旨在基于16S rDNA二代高通量测序,研究早期妊娠女性阴道菌群结构和特点,及其与早期妊娠结局（正常妊娠NP、自然流产SA、输卵管妊娠TP）、妊娠位置（宫内妊娠IUP、输卵管妊娠TP）、中医证型（虚证D、实证E）的关系。方法:研究纳入了停经时间为4~8周、血hCG阳性确定为妊娠的女性。用无菌拭子取参与者阴道侧壁分泌物行阴道六联检和基于Illumina MiSeq平台的16SrDNA测序（V3-V4高变区）。同时采患者静脉血检测血清人绒毛促性腺激素（β-hCG）、孕酮（P）、雌二醇（E2）。随访至14周（98天）判断早期妊娠结局和中医证型。采用QIIME流程结合临床信息分析数据:绘制所有样品的Rank-Abundance曲线,观察整个队列的多样性。在门和属的水平上描述整个队列和不同分组的菌群构成,对于菌型还在种的水平上对其菌群结构进行描述。Alpha多样性指数上,基于PD-whole-tree 分析菌群丰富度,Pielou evenness 分析菌群均匀度,Shannon-Wiener diversity index分析物种多样性（丰富度和均匀度）,并绘制物种稀释曲线。在Beta多样性分析上,于Unweighted Unifrac、Weighted Unifrac距离矩阵分析的基础上进行PCoA和Anosim相似性分析,比较分析组间物种多样性的相似程度。使用LefSe寻找生物标记物。使用CCA分析不同的早期妊娠结局、菌群结构和激素三者的关系。使用hclust对早期妊娠结局、中医证型和菌属进行分层聚类,并绘制heatmap。取结局为输卵管妊娠的女性在早期妊娠时阴道相对丰度>0.01的菌属,先使用广义相加模型（GMA）分别观察各菌属和发生输卵管妊娠的关系。分别建立各菌属的相对丰度和发生输卵管妊娠的ROC模型,重复500次取样,选取AUC最大的菌属的相对丰度作为发生输卵管的预测因子,并得出其相对丰度的最佳阈值。运用机器学习方法中的分类和回归树（CART）对数据进行5次十折交叉验证,进一步验证该菌属对发生输卵管妊娠的预测能力和最佳阈值。经两种模型确定最佳阈值后,将女性早期妊娠阴道菌群按照预测菌属的相对丰度的最佳阈值划分为两型,并研究不同菌型的菌群结构、多样性指数分析,及阴道局部环境及体内激素水平的关系。结果:1.队列和测序信息:最终有100名参与者进入分析,正常妊娠共46人,其中虚证31人,实证15人;自然流产共17人,虚证10人,实证7人;输卵管妊娠共37人,虚证7人,实证30人。所有样品测序深度都足够。2.整个队列的菌群结构:Rank-Abundance曲线提示样品间丰富度差异大,大多数样品有优势物种。从门的水平上,整个队列主要依次由厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门构成。在属的水平上,整个队列主要依次由乳杆菌属、加德纳菌属、奇异菌属、普氏菌属构成。与在门的水平上相比,在属的水平上样品之间物种多样性差异更加明显。作整个队列物种多样性稀释曲线可得所有样品的测序量基本能反映出样品的物种多样性。3.不同的妊娠结局及妊娠位置的早期妊娠时阴道菌群结构:NP、SA女性厚壁菌门（91.08%、91.64%）和乳酸杆菌属（89.21%、88.40%）的优势占比突出,TP女性阴道菌群结构厚壁菌门（75.11%）和乳杆菌属（67.75%）的优势占比被削弱。对于NP、SA、TP三种不同的早期妊娠结局,在Alpha多样性指数、Beta多样性分析上均没有明显差异,P>0.05。对于IUP、TP两种不同的妊娠位置,在Alpha多样性指数分析上TP的 Shannon-Wiener diversity index=1.1（1.0-2.3）,IUP=1.0（0.4-1.7）,P=0.04;在 Beta 多样性分析上,weighted Anosim:R=0.14,P<0.01。经LefSe分析发现,\P女性早期妊娠阴道的生物标志物为:乳酸杆菌科;SA的生物标志物为:芽孢杆菌目;TP的生物标志物为:梭杆菌纲-梭杆菌目-纤毛菌科、放线菌纲、双歧杆菌目-双歧杆菌科。经CCA分析,在三种不同的早期妊娠结局中,NP女性血清激素水平与阴道菌群结构关系最为密切,影响作用从大到小依次为:P>β-hCG>E2;而TP女性血清激素水平与阴道菌群结构存在较大的个体差异。4.不同的中医证型的早期妊娠时阴道菌群结构:虚证厚壁菌门（88.24%）和乳酸杆菌属（85.75%）的占比与实证（82.53%,76.87%）相比更显优势。在Alpha多样性指数分析上,实证的阴道菌群的total OTU=100.5（68.8-145.2）,虚证=78.0（54.8-108.0）,P=0.02;实证的阴道菌群的PD-whole-tree=8.1（6.2-10.0）,虚证=7.1（5.7-8.5）,P=0.03。在 Beta 多样性分析上无明显差异,P>0.05。经LefSe发现,实证女性早期妊娠阴道的生物标记物有:放线菌纲-棒状杆菌目-棒状杆菌科、弯曲杆菌纲-弯曲杆菌目-弯曲杆菌科、葡萄球菌科、芽孢杆菌目、根瘤菌科、变形菌纲、黄色单胞菌目-黄色单胞菌科。而虚证女性阴道无特征性生物标记物。5.不同的妊娠结局结合中医证型的早期妊娠时阴道菌群结构:在每种妊娠结局下都分虚实两种证型,即正常妊娠分虚证NPD和实证NPE、自然流产分虚证SAD和实证SAE、输卵管妊娠分虚证TPD和实证TPE。在门的水平上:同一妊娠结局下,正常妊娠的不同证型在厚壁菌门占比相近（NPD:90.53%,NPE:92.22%）;自然流产虚证厚壁菌门优势占比更明显（SAD:94.68%,SAE:87.31%）;而输卵管妊娠中,却是实证的厚壁菌门的优势地位明显（TPD:68.87%,TPE:76.56%）,虚证中梭杆菌门的占比明显增高（TPD:7.47%,TPE:1.25%）。在属的水平上,正常妊娠和输卵管妊娠各自的虚证、实证下乳酸杆菌占比相近（NPD:88.11%,NPE:91.49%;TPD:63.48%,TPE:68.74%）;但是自然流产虚证和实证相比,虚证乳酸杆菌属优势占比明显（SAD:93.99%,SAE:80.41%）。在Alpha多样性指数分析上,正常妊娠虚证和实证之间、输卵管妊娠虚证和实证之间无明显差异,P>0.05。在自然流产中,total OTU上,SAD:69.5（51.8-94.5）,SAE:120.0（110.0-151.5）,P=:0.01;PD-whole-tree 上,SAD:6.9±1.6,SAE:10.0±3.2,P=0.02。在Beta多样性分析上,正常妊娠虚证和实证之间、输卵管妊娠的虚证和实证之间无明显差异,P>0.05。自然流产组两种证型比较,Unweighted Anosim:R=0.23,P=0.01;weighted Anosim:R=0.18,P=0.047。行聚类分析绘制Heatmap可得:整个队列可以根据乳杆菌属的相对丰度划分为乳杆菌属占支配地位和不占支配地位两组,在乳杆菌属占支配的队列,菌属丰富度和均匀度较低;在乳杆菌属不占支配地位的队列,菌属丰富度和均匀度较高。在早期妊娠结局上,出现了按妊娠位置和乳杆菌属是否占支配位置的聚集:即宫内妊娠在乳酸杆菌属占支配地位处聚集,而输卵管妊娠的在乳杆菌属不占支配地位出聚集。而中医证型未见明显的聚集。6.早期妊娠阴道菌型与输卵管妊娠的发生:我们尝试以单一菌属预测输卵管妊娠的发生。选取此前输卵管妊娠女性早期妊娠时阴道相对丰度>0.01共计7种菌属纳入研究。通过曲线拟合得出相对丰度与输卵管妊娠发生成正相关的有加德纳菌属、普氏菌属、奇异菌属、纤毛菌属、巨球菌属、肠球菌属共6种菌属;而与输卵管妊娠发生成负相关的只有乳酸杆菌属。分别建立7种菌属的相对丰度与发生输卵管妊娠的ROC模型,重复采样500次,其AUC（95%置信区间）从大到小依次是:乳杆菌属0.70（0.58,0.79）,加德纳菌属0.68（0.58,0.78）,肠球菌属 0.66（0.53,0.76）,巨球菌属 0.65（0.48,0.78）,普氏菌属 0.64（0.48,0.78）,纤毛菌属 0.62（0.48,0.81）,奇异菌属 0.61（0.45,0.74）。乳杆菌属对输卵管妊娠的发生预测效果最好,准确度最高（0.73）,相对丰度最佳阈值为0.88。采用CART-5次十折交叉验证进一步验证和计算,乳杆菌属预相对丰度最佳阈值为0.88,预测输卵管妊娠的发生AUC=0.78。根据乳杆菌属相对丰度最佳阈值0.88,将早期妊娠女性的阴道菌群结构分为两型:乳酸杆菌相对丰度<0.88者,为非乳酸杆菌贡献型（NLDM）;乳酸杆菌相对丰度≥0.88者,为乳酸杆菌贡献型（LDM）。队列信息上,NLDM和LDM两种菌型在年龄、体质指数、吸烟史、孕次、异位妊娠史、既往手术史（宫腔操作史、输卵管手术史、盆腔手术史）、盆腔炎性疾病史、停经时间、中医证型上分布无差异（P>0.05）。在妊娠丢失史上,LDM菌型的女性有早期妊娠丢失史的（43.1%）要比NLDM型的女性（17.9%）更多,P=0.02;但是在整个孕期的妊娠丢失,两组却没有明显差异（P>0.05）。在妊娠位置上,早期妊娠时阴道为NLDM型的女性有67.9%发生了输卵管妊娠,P<0.01。菌群结构上,在属的水平上,LDM乳酸杆菌属占绝对优势,达98.79%;而NLDM阴道菌型中,乳酸杆菌属仅占35.74%。在种的水平上,LDM以不可培养的杆菌（54.96%）、惰性乳杆菌（38.16%）和不可培养的乳酸杆菌种（4.72%）为主。而NLDM则由阴道加德纳菌种（22.08%）、惰性乳杆菌（21.48%）、不可培养的杆菌（11.83%）、来源不明的菌种（8.41%）、普氏菌（4.31%）、不可培养的乳酸杆菌种（1.98%）构成,表现出更高的丰富度和均匀性。在 Alpha 多样性指数分析上,PD-whole-tree:NLDM=8.3（7.5-9.5）,LDM=7.0（5.3-8.9）,P<0.01;Pielou evenness:NLDM=0.56（0.39-0.69）,LDM=0.22（0.05-0.26）,P<0.01;Shannon-Wiener diversity index:NLDM=2.6（1.8-3.0）,LDM=1.0（0.2-1.2）,P<0.01。在 Beta 多样性上,weighted Anosim:R=0.12（P=0.04）。在阴道局部环境上,NLDM、LDM两种菌型在阴道流血、过氧化氢、白细胞酯酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶上无差异,P>0.05。对于阴道pH,LDM=4.6（4.2-4.6）,NLDM=4.6（4.6-5.0）,P<0.01。在唾液酸苷酶阳性率上,NLDM（35.7%）明显高于 LDM 组（6.9%）,P<0.01。在机体激素水平上,β-hCG:NLDM=1972.5（253.0-13969.5）mIU/mL,LDM=8968.0（1393.5-56514.0）mIU/mL,P=0.03;P:NLDM=8.6（4.3-18.0）ng/ml,LDM=17.0（7.2-25.3）ng/ml,P=0.01;E2:NLDM=110.2（35.2-385.8）pg/ml,LDM=418.6（144.8-797.3）pg/ml,P<0.01。结论:1.早期妊娠女性阴道菌群结构个体间差异大,但大多以厚壁菌门和乳酸杆菌属占优。2.早期妊娠,乳酸杆菌科可作为正常妊娠的阴道生物标志物;芽孢杆菌目可作为自然流产的阴道生物标志物;梭杆菌纲-梭杆菌目-纤毛菌科、放线菌纲、双歧杆菌目-双歧杆菌科均可作为输卵管妊娠的阴道生物标志物。3.正常妊娠、自然流产、输卵管妊娠三种不同的早期妊娠结局,其早期妊娠时阴道菌群多样性无差异,结构相似。4.正常妊娠女性血清激素水平与阴道菌群结构关系最为密切,从大到小依次为:P>β-hCG>E2。5.与宫内妊娠相比,输卵管妊娠的菌群多样性稍高,两者菌群结构稍有差异。6.早期妊娠,放线菌纲-棒状杆菌目-棒状杆菌科、弯曲杆菌纲-弯曲杆菌目-弯曲杆菌科、葡萄球菌科、芽孢杆菌目、根瘤菌科、变形菌纲、黄色单胞菌目-黄色单胞菌科均可作为实证的阴道生物标志物。7.早期妊娠,中医辨证为实证的阴道菌群丰富度要明显高于虚证,但两种证型的菌群结构相似。8.早期妊娠,阴道菌群在不同证型间的差异主要体现在自然流产中。在自然流产中,实证的阴道菌群丰富度明显高于虚证,两种证型的菌群结构差异显著。9.早期妊娠,阴道加德纳菌属、普氏菌属、奇异菌属、纤毛菌属、巨球菌属、肠球菌属的相对丰度与发生输卵管妊娠呈正相关,而乳酸杆菌属的相对丰度与发生输卵管妊娠成负相关。10.早期妊娠,阴道乳酸杆菌的相对丰度能很好预测输卵管妊娠的发生。根据乳酸杆菌相对丰度的最佳阈值0.88可将早期妊娠女性阴道菌群结构划分成乳酸杆菌贡献型（LDM）和非乳酸杆菌贡献型（NLDM）。NLDM女性更容易发生输卵管妊娠。11.取材时是否有阴道流血不影响NLDM和LDM的分型。两种菌型相比较,LDM的乳酸杆菌属占绝对优势,阴道分泌物pH更低,血清β-hCG、P、E2水平更高;NLDM乳酸杆菌属不占优势,但其菌群多样性更高,阴道分泌物中唾液酸苷酶检出率也更高。但NLDM型菌型并没有反应出更为严重的阴道粘膜损伤。