酶的定向进化是改变酶的结构和性质满足工业化需求的有效途径,现在定向进化技术已被用于上百个酶的进化,大大提高了生物酶的活性和效率,在工业、农业、生物制药等方面产生了巨大影响。酶的定向进化的成功与否主要取决于所构建的突变文库是否具有足够大的多样性及库容量。以易错PCR为代表的随机突变技术和以DNA改组技术为代表的DNA重组技术是目前常用的两种定向进化技术。针对现有的构建文库方法的缺点,本论文设计了一种基于蛋白质二级结构组合原理构建突变体文库的新方法。以原有蛋白质的二级结构单元为模块进行重组,相较于现有的文库构建方法,本方法模块重组多样性高,且并未破坏蛋白质的结构功能单元,形成有功能突变体的几率较高。为便于筛选,以卡那霉素抗性基因作为实验对象。首先分析同源性低的卡那霉素抗性蛋白的结构功能信息,选取其二级结构及重要催化活性中心区域为基本组合模块。以A-T连接及酶切产生粘性末端连接两种方法构建突变体文库。最终,利用本方法筛选得到了10个有效突变体,最高抗性达到1920 ng/μL(即为常用卡那霉素抗性的64倍)。综上所述,本论文利用蛋白质二级结构组合原理构建的突变体文库方法,筛选得到了一个卡那霉素抗性显著提高的突变体。本实验必将对现有基因文库难以筛选的一些目标,如预防和治疗新发现的病毒等发挥积极的作用,并可以从中筛选出任意所需要的蛋白质或酶来满足工业、医药业、食品业等多种行业对于蛋白质或酶的需要。