随着温室气体排放增加,全球气候变暖导致极端天气事件发生频率明显增加,各种极端气候事件,如强寒潮、干旱和洪涝灾害等对农业生产造成了严重影响。玉米是世界上最重要的粮食作物、饲用作物和能源作物之一。而且由于起源于热带地区,玉米是典型喜温喜光的C4植物,对温度条件要求较高,易受低温冷(冻)害的影响。在我国玉米生产中,春季和秋季的霜冻对玉米产量易造成严重影响,尤其是对北方春播玉米区和西北灌溉玉米区,而且春季霜冻的频次要高于秋季霜冻。东北地区是我国玉米的主产区,而黑龙江省玉米常年种植面积已达到粮食作物总面积的一半以上,为我国玉米播种面积最大的省份。近年来由于玉米需求的刚性增长和玉米种植比较效益的提高,黑龙江省玉米种植区域已经发展到第6积温带,玉米跨区种植的情况非常严重。与此同时,近年来黑龙江省春季常有雨雪冰冻天气,玉米播种期易遇倒春寒而推迟,直接影响玉米的正常播种,而且玉米幼苗期也易遭受倒春寒而出现冻害损伤,影响玉米的正常生长,并最终造成减产。因此,开展玉米苗期抗冻性研究,筛选玉米抗冻种质资源,探究玉米苗期抗冻性生理生化机制,挖掘玉米在低温胁迫下的抗冻基因,进而开展玉米抗冻性分子标记辅助育种等相关方面的研究,对于解决黑龙江省玉米冷(冻)害问题具有重要而深远的理论和实践意义。本研究利用30份黑龙江省常用玉米自交系,开展了玉米苗期抗冻性鉴定及相关生理指标测定,同时结合转录组测序技术,对具有不同抗冻性的玉米自交系苗期冻害胁迫响应基因及相关代谢通路进行了比较分析,研究结果如下:一、玉米苗期抗冻性的高效鉴定方法本研究选取三叶一心期的玉米自交系幼苗放置于-1℃的培养箱中分别进行1h、3h和5h的冻害处理,之后放置于正常培养条件的培养箱中恢复3天,3天之后统计幼苗存活率,以幼苗存活率来作为抗冻性的测量指标。结果显示冻害胁迫处理3小时的幼苗存活率从5.01%到97.3%不等,呈现正态分布,能够有效的区分不同自交系的抗冻性,因此将冻害胁迫时间3小时作为有效鉴定玉米苗期自交系抗冻性的处理时间。并且筛选出两份极端自交系用于后续研究,其中,自交系KR701在冻害处理3小时之后的幼苗存活率为97.3%,作为抗冻自交系;Hei8834在冻害处理3小时之后的幼苗存活率为5.01%,作为冻害敏感自交系。二、冻害胁迫下玉米苗期生理机制分析Hei8834在冻害处理之后表现出明显的叶片萎蔫、失绿,台盼蓝染色后显微观察也发现冻害处理之后Hei8834的叶片气孔张开并呈现深蓝色,说明其叶片受冻害损伤严重。同时,冻害处理后,Hei8834的相对电导率在0.5小时和1小时分别为0.13和0.87,表明Hei8834在冻害处理0.5小时到1小时之间冻害损伤明显加剧;同时超氧化物歧化酶活性在冻害处理后1小时达到最高值57.3 U/mg,之后便开始下降;过氧化物酶活性在冻害处理后0.5小时达到最大值53.7 U/mg,之后也呈现下降趋势;可溶性蛋白和可溶性糖含量都是在冻害处理之后一直缓慢升高。KR701的相对电导率在冻害处理之后一直维持0.2以下;超氧化物歧化酶活性在冻害处理之后上升趋势高于Hei8834,而且在2小时达到最高值80.8,之后略有降低;过氧化物酶活性在冻害处理之后一直处于上升趋势;可溶性蛋白含量在冻害处理之后也是上升趋势;可溶性糖含量在冻害处理之后也是一直升高,直到2小时之后维持相对稳定水平,并有下降趋势。因此,冻害敏感自交系Hei8834在冻害处理1小时之后,冻害损伤明显,冻害抵抗机制已失效;而抗冻自交系KR701在冻害处理3小时以内,冻害损伤较小,冻害抵抗机制有效的保护了细胞免于冻害损伤,但是在2小时到3小时之间,有些生理指标(超氧化物歧化酶活性和可溶性糖)已经开始略微呈现下降趋势,暗示冻害处理时间如再延长,抗冻自交系KR701的抗冻机制也不能有效抵抗冻害胁迫。三、不同抗冻性玉米自交系幼苗冻害胁迫前后的转录组测序分析对这两份极端材料在幼苗期冻害处理之前和冻害处理之后进行转录组测序,共得到大约154.4百万长度为101 bp的序列,其中78.84%(121.8百万)的序列能比对在玉米参考基因组Zea_mays_Ensembl_AGPv3。聚类分析及主成分分析(PCA)结果显示,抗冻自交系KR701在冻害处理之前和冻害处理之后的样本归为一类,冻害敏感自交系Hei8834在冻害处理之前和冻害处理之后的样本归为一类,导致不同样本间基因表达量最大差别的因素为自交系之间的差异。4个不同处理的7个样本中,共有19794个基因表达,其中有360个基因在抗冻自交系KR701中经过冻害胁迫之后特异表达,489个基因在冻害敏感自交系(Hei8834)在冻害胁迫之后特异表达。共有4550个基因在4个不同的处理(两份自交系之间以及冻害处理前后)中的表达量存在差异(即为差异表达基因,DEG)。对这些特异表达基因和差异表达基因分别进行了基因本体论分析(GO分析),结果发现冻害处理后冻害敏感自交系特异表达的基因与抗冻自交系特异表达的基因相比,特异的参与了一些生物学过程,如低温响应、有机酸转运,此外泛素连接酶复合体组分也显著富集。这也从转录水平上说明冻害敏感自交系在冻害处理中受到的损伤较为严重,从而触发了更多的生物学过程。同时,虽然许多GO条目在两个自交系冻害处理后特异表达的基因中都有出现,但是这些GO条目在两个自交系所富集的显著程度不同,说明参与同一GO的基因在两个自交系中所占的比例是不同的。对抗冻自交系冻害处理前后的439个差异基因和冻害敏感自交系冻害处理前后的852个差异基因分别进行了GO分析,结果发现在生物学过程分类中,抗冻自交系中富集最为显著的是冻害响应,而冻害敏感自交系富集最为显著的是低温响应;在分子功能分类中,抗冻自交系中富集最为显著的是结合活性,而冻害敏感自交系富集最为显著的是蛋白质酪氨酸激酶活性;在细胞组分分类中,抗冻自交系中有三个GO条目显著富集,均为膜组分相关,而冻害敏感自交系富集最为显著的是泛素连接酶复合体。此外我们对在两个自交系间冻害响应存在显著差异的基因进行了拟南芥同源基因功能检索,结果鉴定到许多参与逆境响应和植物激素信号通路相关的基因。这些基因的后续分析将会增加我们对玉米幼苗在早期冻害胁迫下响应冻害的分子机制的认识,并对玉米抗低温育种提供良好的育种策略。最后,挑选出30个基因进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证,结果显示转录组测序结果和qRT-PCR验证结果在抗冻材料和冻害敏感材料中的相关系数分别是80%和50%,说明转录组分析结果与qRT-PCR结果吻合度较高。