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前言对梗死相关血管迅速而有效的开通，极大地提高了急性心肌梗死的抢救成功率，并改善患者的预后。但是，再灌注也能增加组织的损伤，这在一定程度上降低了再灌注疗效。研究认为再灌注损伤途经主要由核因子-κB（NF-κB）所介导，NF-κB的激活将引起一系列炎症因子和凋亡基因的表达，与再灌注损伤有关。如何抑制NF-κB的激活，减少细胞凋亡，限制再灌注损伤成为关注的焦点；另外，如何迅速、无创评价再灌注后心肌局部及整体功能，了解再灌注的效果也是目前研究的热点。故本研究采用定量组织速度及应变率成像观察犬心肌缺血再灌注后局部心肌收缩功能和左室整体收缩功能，应用特异性NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（pyorrole dithitocarbamate，PDTC）研究其对心肌缺血再灌注损伤的影响，探讨其在缺血再灌注细胞凋亡过程中的作用，并探讨细胞凋亡与心功能的关系，以期从基因水平为防治缺血性心肌损伤探索一种新途经。方法第一部分：将30只犬随机分为三组：对照组（Con组，n=10），：仅于LAD下穿线，不结扎；缺血再灌注组（IR组，n=10）：单纯阻断LAD 30 min，再灌注120 min。二硫代氨基甲酸吡咯烷组（PDTC组，n=10）：阻断LAD前经静脉给予PDTC（100mg／kg），其余步骤同IR组。实验犬分别于缺血前、缺血30min、再灌注即刻及再灌注120 min时行以下各项检查。定量组织速度及应变率检测方法：分别取三组犬心尖四腔、两腔和左室长轴切面，待图像调整满意后转换成TVI（tissue velocity imaging）程序，连续记录至少三个完整心动周期的动态组织速度图像储存待分析。心肌大体病理检测：将LAD重新结扎，伊文思蓝及氯化三苯四氮唑（TTC）溶液染色显示缺血心肌，立即对切片拍照待分析。心肌组织特染（苏木素碱性复红苦味酸染色）：取出左室前壁心肌组织，甲醛固定，石蜡切片，用明矾苏木素及碱性复红染色，用苦味酸丙酮液分化，二甲苯透明，树胶封固。心肌组织透射电镜检查：取左室前壁心肌组织，大小约1mm3，25％戊二醛溶液固定，常规电镜切片，采用透射电镜观察心肌超微结构。第二部分：凋亡细胞检测：采用原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的荧光素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法（TUNEL）。取三组缺血区心肌组织，石蜡切片4-6μm，采用Roche公司检测试剂盒进行凋亡细胞检测，计算阳性细胞指数。心肌总RNA的提取及半定量RT-PCR检测caspase-3 mRNA的表达：取三组缺血区心肌各100 mg剪碎，用Trizol 1000μl匀浆、抽提组织总RNA，核酸测定仪检测总RNA浓度，A260／280为1.8～2.0。应用RT-PCR法检测caspase-3 mRNA的表达。引物设计如下：caspase-3（176bp）：上游5’-CATGGCCTGTCAGA AAATAC-3’，下游5’-TAACCCGAGTAAGAATGTGC-3’，内参GAPDH（194bp）：上游5’-GGAGAAAGCTGCCAAATATG-3’，下游5’-ACCAGGAAATGAGCT TGACA-3’。反应体系：10×Buffer（各10mM）2.5μl，Rnase抑制剂（40u／μl）0.5μl，MgCl2 5.0μl，AMV Rtase（5u／μl）0.5μl，AMV-Optimizard Taq（5u／μl）0.5μl，GAPDH上游引物（10pmol）0.5μl，GAPDH下游引物（10pmol）0.5μl，CASPASE上游引物（20pmol）0.5μl，CASPASE下游引物（20pmol）0.5μl。反应条件：变性94℃60s，退火56℃60 s，延伸72℃2 min，延伸30个循环，终延伸72℃7 min。反应产物用4％琼脂糖凝胶电泳（100V，40 min），紫外灯下观察结果并摄片，凝胶成像系统（Labwork 3.0）软件分析进行图像分析，以caspase-3与GAPDH扩增条带的辉度值比值来评定caspase3 mRNA表达水平。蛋白印迹分析（western-blot）定量检测NF-κB的表达：行核蛋白提取，Forlin-酚蛋白定量法行蛋白浓度测定。取50μg核蛋白行10％SDS-PAGE蛋白电泳并将蛋白转至NC膜上，转移后的NC膜于封闭液中37℃封闭2h，一抗为兔抗犬NF-κB抗体（1：200），二抗为辣根过氧化物酶标化的羊抗兔抗体（1：10000），最后通过DAB显色。计算机扫描，采用图象分析软件（Lab-work3.0）比较目的条带吸光度值（AValue）。免疫组化法测caspase-3蛋白的表达：将待检心肌标本用10％中性甲醛液固定。石蜡切片4-6μm，灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原活性，血清封闭，滴加1：200抗犬caspase-3抗体，4℃孵育过夜。滴加荧光素化相应二抗，加链霉素—荧光素—过氧化物酶复合物，二氨基联苯胺（DAB）显色。光镜下计算阳性细胞指数。免疫组化法测NF-κB蛋白的表达：将待检心肌标本用10％中性缓冲甲醛液固定，石蜡切片4-6μm。灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原活性，血清封闭，滴加1：200抗犬NF-κBp65抗体，4℃孵育过夜。滴加相应二抗，加链霉素—荧光素—过氧化物酶复合物，二氨基联苯胺（DAB）显色。光镜下计算阳性细胞指数。实验结果第一部分：1．缺血前基础状态，三组犬左室前壁增厚率无明显差异。IR组与PDTC组冠脉结扎即刻前壁增厚率明显低于Con组。冠脉结扎后30 min，左室前壁增厚率进一步下降。再灌注120 min后，左室前壁增厚率几乎接近缺血前。2．缺血30 min EF无显著下降，再灌注即刻EF下降，以后EF逐渐恢复，至再灌注120min，PDTC组EF几乎接近缺血前，与IR组比较有显著差异。3．缺血30 min时Vs峰值较闭塞前明显降低、后移。IR组与PDTC组均观察到PSS。再灌注120 min时PDTC组Vs测值较同一时点IR组Vs高；此时PSS节段数也少于IR组。4．缺血30 min时SRs较闭塞前明显降低。IR组与PDTC组均观察到PSS。再灌注120 min后PDTC组SRs测值较同一时点IR组SRs高；此时PSS节段数也少于IR组。5．缺血前Con组、IR组及PDTC组左室整体收缩功能EF与左室前壁应变率均呈显著负相关，相关系数分别为rCon=-0.88，rIR=-0.73，rPDTC=-0.69。第二部分：1、IR组缺血区TUNEL凋亡指数与Con组比较有显著性差异；PDTC组心肌TUNEL凋亡指数较Con组虽仍有显著性差异，但与IR组比较已明显减少。2、IR组caspase-3 mRNA表达高于对照组，而PDTC组表达明显低于IR组。3、与Con组比较IR组caspase-3阳性细胞指数明显增加，而PDTC组的阳性细胞指数与Con组比较差异仍有显著意义，但PDTC组与IR组比较已明显减少。4、IR组核蛋白NF-κB表达增加；PDTC组NF-κB表达量明显减少。5、与Con组比较IR组NF-κB阳性细胞指数明显增加，而PDTC组的阳性细胞指数与Con组比较差异仍有显著意义，但PDTC组与IR组比较已明显减少。6、Con组、IR组及PDTC组左室前壁局部收缩功能SR与TUNEL阳性细胞指数均呈显著正相关，相关系数分别为rCon=0.92，rIR=0.69，rPDTC=0.94。结论1、TVI及SR技术可以准确、定量评价局部心肌收缩功能变化，且SR评价左室收缩功能与EF有良好的相关性。2、缺血再灌注可激活NF-κB，上调caspase-3mRNA，伴caspase-3蛋白的表达增强及心肌细胞凋亡指数增高，局部心肌功能减低，且局部心肌功能与细胞凋亡显著相关。3、经PDTC预处理抑制NF-κB的活性，阻断NF-κB的激活，可能通过下调caspase-3mRNA，减少细胞凋亡及凋亡蛋白的表达，改善心局部功能。