DNA甲基化是真核生物基因表达调控的一种方式。在哺乳动物，DNA甲基化发生在二核苷酸胞嘧啶(CpG)的第5位碳原子上，即5-甲基胞嘧啶(5-mc)。人类的CpG以两种形式存在，一种是分散于DNA中，另一种是CpG结构高度聚集的CpG岛。在正常组织里，CpG岛则是非甲基化的。 研究发现，同正常组织相比，部分肿瘤组织DNA普遍低甲基化，部分CpG的甲基丢失是肿瘤细胞的重要特征。DNA的低甲基化可以使染色质凝聚发生障碍，干扰中期染色体的配对和分离，促进染色体的不稳定性，使染色体断裂、易位和丢失，激活原来保持沉寂状态的基因如生长促进基因特别是原癌基因的表达。基因组范围的DNA低甲基化是癌变过程中早期的分子异常之一。 在肿瘤细胞里，DNA的局部高甲基化与普遍的低甲基化是共存的，此种高甲基化主要发生在正常情况下表现为非甲基化的CpG岛上，CpG岛的高甲基化是在编码降钙素的基因上首次发现的。CoG岛的甲基化改变了染色质结构和／或抑制了转录因子的结合。 5-氮胞苷(5-azaC)最开始作为一种抗癌药，可杀伤处于S期的细胞，对于β-地中海贫血也可以减轻症状。作为抗癌药，主要用于乳腺癌、肠癌和黑色素瘤等，而且也是一种治疗非淋巴细胞白血病的药物。5-azaC嘧啶环上的C5被N代替，因此，当它整合到DNA时，就不能被甲基化，并且能使基因组DNA去甲基化，从而使细胞许多沉寂基因激活，细胞表型改变，在体外5-azaC还第四军医大学博士学位论文能诱导非成熟细胞的分化，它可以使许多成熟的细胞和处于胚胎时期的细胞分化成其它类型的细胞。 细胞凋亡(ap叩tosis)又称为细胞程序性死亡，是细胞自主死亡的过程，在组织发生、免疫系统克隆选择、机体内环境稳定等诸多方面有着广泛的生物学意义。在某些疾病，如肿瘤、艾滋病等发病机制中也具有重要意义。参与细胞凋亡基因很多，主要有Bcl一2、c一myc、p53、ced一3、Fas/APo一l等。许多不同类型的细胞用5一azaC处理后都可以引起一些沉寂基因的表达包括凋亡基因和细胞表型的转化。 涎腺肿瘤是头颈部好发肿瘤，目前以手术、放化疗为主，晚期疗效差，有必要探索新的治疗方法。目前还未见有关于用5一azaC治疗涎腺肿瘤的报道，为了探讨5一azaC治疗涎腺肿瘤的应用前景，本实验以HSG细胞为对象，围绕5一azaC做了以下几个方面的工作: l用sumol/L、loumol/L的5一azae处理HsG细胞后，细胞的生长状态发生了变化。部分细胞从瓶底脱落到培养液中，从生长曲线上可以看到细胞生长受到抑制，抑制率分别为82%和95%，琼脂克隆试验表明加入sum。比5一azaC处理后细胞克隆形成率降低，由39.7%降为19.6%，细胞分裂指数检测表明5一azaC处理后细胞分裂指数降低，由21 .6%变为12.6%，细胞周期检测发现细胞周期主要被阻断在Gl期，免疫组化染色发现5一azaC处理后PCNA和CycfinDI表达较处理前减弱，嗜银蛋白染色分析表明5一azaC处理后嗜银蛋白颗粒减少。HSG细胞用5一azaC处理后接种到裸鼠皮下，与对照组相比，5一azaC处理组细胞成瘤性降低，肿瘤的重量由0.5510士0.11889降为0.1395士0.02149。以上结果都表明5一azaC可以抑制HSG细胞的生长。 2用sumo比5一azac处理HsG后，细胞形态发生了一些变化，胞浆中出现类似颗粒状物，RT一PCR产物检测结果可见用5一azaC处理后在20 lbP处出现光亮条带，而对照组则未见到，说明HSG第四军医大学博士学位论文细胞可能分化成了腺泡细胞。 3 sumoljLS一azaC处理HSG24h、4sh、72h后进行流式细胞仪检测，结果发现5一azaC处理后，HSG细胞Gl期前面出现亚二倍体峰，光镜观察可见部分细胞有出芽、发泡现象，细胞体积缩小，电镜观察可见核内染色质浓缩，形成染色质块聚集在核的边缘，或形成指环平铺在核膜下。胞质回缩，细胞膜发泡，出现凋亡小体。 4 sumo比5一azaC可以使HSG细胞发生凋亡，免疫组化结果显示用5一azaC处理后HSG细胞FAP一l表达减弱，说明FAP一1在5一azaC诱导的HSG凋亡中起一定作用。琼脂糖电泳结果可见5一azaC处理后形成DNA ladder，W七stern blot结果显示5一azaC处理后，F妙一1蛋白表达降低。将HSG进行FAP一1反义寡核昔酸转染，转染后，HSG细胞形态未发生明显变化，RT一PCR产物凝胶电泳可见607bp附近出现光亮条带，说明FA卫一1反义寡核普酸己成功转入HSG细胞，用5一azaC处理转染FAP一1反义寡核普酸的HSG细胞后，细胞凋亡数较转染前增加。以上结果说明FAP一1在5一azaC诱导的HSG细胞凋亡中起一定作用。另外，5一azaC处理后，be卜2和p53表达减弱，说明bcl一2和p53也可能与5一azaC诱导的HSG细胞的凋亡有关。 上述研究结果表明，5一azaC具有抑制HSG细胞增殖的作用，能诱导HSG细胞使之向更成熟的细胞分化，以及诱导细胞凋亡。因此，通过更深一步的研究，有望成为治疗涎腺肿瘤的有效药物，本研究为以后5一azaC治疗涎腺肿瘤的临床应用提供理论和实验依据。