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苹果是世界上栽培面积最大的果树之一,具有较高的营养价值和经济价值。西北黄土高原地区是我国最重要的苹果产区,但是干旱和斑点落叶病等不利因素对该地区苹果产业的发展危害严重。本研究从前期的新疆野苹果（Malus sieversii）转录组数据中筛选到一个干旱响应基因ZAT5（编码C2H2型锌指蛋白）,对其在干旱和苹果斑点落叶病胁迫中的生物学功能和分子机制进行了深入的探究,同时对MdZAT5的上游调控因子MdWRKY33的生物学功能和调控机理进行了研究,主要结果如下:1.MdZAT5提高了苹果的抗旱性PEG（Polyethylene glycol）模拟的干旱处理和自然干旱处理均能诱导MdZAT5的表达。ZAT5在物种进化过程中非常保守。MdZAT5是一个具有核定位的转录因子。q RT-PCR结果显示MdZAT5在苹果的根、茎、叶中均有表达,且对ABA、低温、干旱、盐胁迫均有响应。MdZAT5 RNAi转基因株系经短期干旱处理后,其存活率降低,叶片萎蔫程度、细胞膜受损程度和过氧化氢含量均高于GL-3（非转基因苹果植株）,并且CAT和POD活性低于GL-3。而MdZAT5过表达转基因苹果植株则表现出与RNAi株系相反的表型。此外,长期干旱条件下,沉默MdZAT5显著降低了苹果对干旱的适应能力。表明MdZAT5具有提高苹果抗旱性的功能。2.MdZAT5干旱胁迫下正调控干旱响应基因和mi RNAsDAP-seq试验确定了MdZAT5的共有结合基序T/ACACT/AC/A/G。Ch IP-q PCR和EMSA结果表明MdZAT5可直接与干旱响应基因（Md RHA2A,Md LEA14）,活性氧清除相关基因（Md CAT3,Md TPX1）以及干旱胁迫相关mi RNAs（Mdmmi R171i,Mdm-mi R172c）的启动子区域结合,通过调控这些干旱响应基因/mi RNAs的表达,提高苹果植株的抗旱性。通过酵母双杂交文库筛选,获得了MdZAT5的两个互作蛋白:Md TPL2（TOPLESS 2）和MdHYL1（HYPONASTIC LEAVES1）。酵母双杂交、Split-Luc及Co-IP验证了MdZAT5与MdHYL1存在相互作用,同时发现MdZAT5能够直接与MdHYL1的启动子区域结合,且在正常条件下,MdZAT5抑制MdHYL1的表达及mi RNAs的生物合成,但在干旱条件下,促进MdHYL1和干旱响应mi RNAs的积累。进一步利用Split-Luc及RIP-q PCR发现MdZAT5在正常条件下抑制MdHYL1与Md DCL1以及pri-mi RNA的互作,但在脱水条件下其抑制作用消失。表明在干旱胁迫下,MdZAT5通过激活MdHYL1的表达,促进MdHYL1与Md DCL1以及primi RNA的互作,进而正调控干旱响应mi RNAs的生物合成,提高植物的抗旱能力。3.MdWRKY33负调控苹果对干旱胁迫的耐受性酵母单杂交、Ch IP-q PCR及EMSA试验表明MdWRKY33是MdZAT5的上游调控因子。同时,MdWRKY33能直接与MdHYL1的启动子结合,并通过负调控MdHYL1,进而抑制mi RNAs的生物合成。但在干旱条件下,MdWRKY33不调控MdZAT5及MdHYL1的基因表达。MdWRKY33是一个定位于细胞核的转录因子。MdWRKY33在苹果根、茎、叶中均能表达,并且受自然干旱和PEG模拟干旱诱导。跟GL-3相比,过表达MdWRKY33的转基因组培苗的失水率更高,同时在PEG处理后,MdWRKY33的过表达转基因愈伤的相对生长速率显著低于野生型。表明,MdWRKY33是苹果抗旱的负调控因子。此外,Ch IP-q PCR及EMSA试验发现,干旱正调控因子Md MYB88直接结合MdWRKY33的启动子,并在对照和脱水条件下负调控其表达。4.MdWRKY33-MdZAT5正调控苹果对斑点落叶病的抗病性苹果斑点落叶病菌侵染过程能够诱导MdZAT5和MdWRKY33的表达。跟GL-3相比,MdZAT5 RNAi转基因植株对斑点落叶病更敏感,其叶片中木质素含量显著降低,而过表达MdZAT5则提高了转基因苹果中的木质素含量及植株的抗病能力。q RT-PCR结果显示,接种斑点落叶病菌后,MdZAT5负调控Md MYB3（苯丙烷代谢途径的负调控因子）,正调控Md C4H（木质素生物合成相关基因）的表达。进一步分析发现MdZAT5可与Md MYB3和Md C4H的启动子区域结合,从而在接种斑点落叶病菌后,通过调控其转录水平,促进木质素合成,进而提高植株的抗病性。在GL-3叶片中瞬时沉默和过表达MdWRKY33基因后接种斑点落叶病菌,结果显示,沉默MdWRKY33降低了苹果叶片对斑点落叶病的抗性,其病斑面积显著大于GL-3,而过表达MdWRKY33叶片的病斑面积显著小于GL-3。q RT-PCR结果显示MdWRKY33在斑点落叶病胁迫下正调控MdZAT5的基因表达。以上结果表明,MdWRKY33通过正调控MdZAT5,提高苹果的抗病性。5.MdWRKY33能够与SUMO化修饰相关蛋白发生互作通过酵母双杂交文库筛选,获得了MdWRKY33的三个互作蛋白:Md MKS1、Md SIB2和Md CE。利用酵母双杂交及Split-Luc验证了MdWRKY33与这三个蛋白存在相互作用。进一步分析发现,MdWRKY33可以被Md SUMO2A和Md SUMO2C修饰。同时,利用在线网站SUMOplotTMAnalysis Program对MdWRKY33的SUMO化修饰位点进行了分析。