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异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是TCA循环中的关键酶,作为一种看家蛋白,IDH在能量代谢及合成代谢中起重要作用。IDH催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸和CO2,并将NAD(P)+还原成NAD(P)H。根据辅酶特异性不同,IDH可分为NAD+依赖型IDH(NAD-IDH,EC 1.1.1.41)和NADP+依赖型IDH(NADP-IDH,EC 1.1.1.42);根据亚基的组成不同,又可分为单体、同源二聚体、同源四聚体及异源寡聚体等类型。系统发生分析表明,NAD+依赖型是细菌IDH的古老表型,而NADP+依赖型则是适应性进化的结果,而且这种辅酶特异性的功能进化机制已在大肠杆菌中得以验证。然而,对于单体IDH来说,目前报道的都是NADP+依赖型酶,单体NADP-IDH的祖先蛋白仍不清楚。本研究重建了IDH蛋白家族的系统发生树,将其分为三大类:I类IDH(Type I IDH)、II类IDH(Type II IDH)和单体IDH(Monomeric IDH)。且发现在系统发生树上的单体IDH亚家族中,来自弯曲菌属的IDH单独聚成一个进化分枝,与单体NADP-IDH的进化分枝相邻。序列比对显示,该类新型IDH辅酶结合位点的关键残基与单体NADP-IDH的关键残基不同。本研究合成了弯曲菌Campylobacter sp.FOBRC14的IDH基因(CaIDH),并将其异源表达。SDS-PAGE分析显示,纯化的CaIDH亚基分子量约为81 kDa,MALDI-TOF/TOF质谱检测其全酶分子量为81.9 kDa,表明CaIDH是单体结构。酶学性质结果显示,CaIDH的活性依赖于二价金属离子的存在,Mn2+是其最佳激活剂。当以Mn2+和Mg2+为激活剂时,Ca IDH的最适pH值分别为7.5和8.0,最适温度分别为40°C和45°C。热稳定性研究表明,当温度在0-45°C的范围内时,CaIDH的活性比较稳定,在45°C以上时,酶活性迅速下降。活性检测结果显示,当以NAD+为辅酶时,CaIDH的比活力为54.6 U/mg,而以NADP+为辅酶时,其比活力仅为11.3 U/mg。动力学参数表明,CaIDH对NADP+的Km值分别是其对NAD+的Km值的4.2倍(Mn2+)和17.8倍(Mg2+),显然CaIDH对NAD+的亲和力远高于其对NADP+的亲和力。在Mn2+或Mg2+条件下,CaIDH对辅酶NAD+的偏好性[(kcat/Km)NAD/(kcat/Km)NADP]分别是其对NADP+偏好性的19.4倍和61倍,表明CaIDH是典型的NAD+依赖型IDH。根据推测的辅酶结合位点(Leu584和Asp595),应用定点突变技术,构建了突变体酶CaH584R595。圆二色谱分析显示突变没有造成蛋白质二级结构的明显改变。突变体酶动力学参数测定显示,突变体酶CaH584R595对辅酶NADP+的Km值分别为76.5μM(Mn2+)和11.4μM(Mg2+),对NADP+的亲和力比野生型酶分别提高了9.7倍(Mn2+)和45倍(Mg2+),催化效率也分别提高了27倍(Mn2+)和92倍(Mg2+),而对NAD+的亲和力和催化效率都明显降低。突变体酶对NADP+的偏好性分别是其对NAD+的14.5倍(Mn2+)和19倍(Mg2+),CaIDH的辅酶特异性已经成功的由NAD+-依赖型转换成了NADP+-依赖型。由此可见,单体NAD-IDH可能是一直未被发现的单体NADP-IDH的祖先蛋白。本研究还通过同源重组技术,以E.coli MG1655菌株为基础,构建了包含CaIDH及其突变基因的重组菌株,即MG::CaIDH和MG::CaH584R595。在葡萄糖或乙酸中培养4个菌株,分别是2个重组菌株、包含E.coli野生型二聚体IDH(EcIDH)的E.coli MG1655菌株(简称E.coli WT)、包含改造的NAD+依赖型EcIDH的E.coli MG1655突变菌株(简称E.coli Ym)。测定4个菌株在不同碳源条件下的生长速率。在葡萄糖中时,MG::CaH584R595的生长速率为E.coli WT的82%,其余3个菌株的生长速率比较接近。在乙酸中时,所有突变菌株的生长速率都低于E.coli WT,MG::CaH584R595的生长最慢,其生长速率仅为E.coli WT的65.5%,这可能与其IDH活力较低有关。尽管在自然界中没有发现任何单体IDH能像二聚体EcIDH那样,其活性受到磷酸化作用的调控,但是综合上述结果可见,在碳源贫瘠的环境中,单体IDH能够取代二聚体IDH发挥功能。利用组学技术,对不同碳源条件下4个菌株的代谢途径的进一步分析工作在进行中。新型单体NAD-IDH的发现是对IDH蛋白家族分类信息的重要补充,并为单体IDH分子进化机制的研究奠定了扎实的基础。