立体选择性氧化还原酶是一种用于手性化合物合成的重要生物催化剂,具有产物光学纯度高,反应条件温和,环境友好等特点。目前已经有超过200种微生物可以不对称还原羰基化合物用来合成手性醇。手性醇是具有高附加值手性化合物合成的关键中间体,被广泛用于医药、农药、食品等不同领域的多种功能性手性化合物的不对称合成。近些年随着不同光学异构体药理作用研究的深入及医药监管部门对市售外消旋药物审批愈加严格,因此研究和开发光学纯度高的手性药物正成为新药入市的关键和巨大的利润增长点。利用生物催化技术来合成手性药物及其中间体由于其特有的优势而受到更多的关注,成为近年来国内外的研究焦点。光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(R)-HPBE]是血管紧张素转换酶抑制剂等普利类药物合成的关键手性中间体。克鲁斯假丝酵母Candida krusei SW2026可用于还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)生成(R)-HPBE。本研究对该菌体内的关键立体选择性羰基还原酶进行分离纯化、性质研究以及基因序列的研究,具有较好的现实意义和理论价值。　　 从Candida krusei SW2026中分离得到了NADPH依赖型羰基还原酶。粗酶经硫酸铵分级沉淀(40-90％)、HiPrep DEAE FF离子交换层析、HiTrap Blue HP亲和层析、SuperdexTM75分子筛层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,蛋白亚基的分子量为46kDa,通过分子筛层析检测为单一洗脱峰,其表观分子量为45.5 kDa。　　 研究了该羰基还原酶的酶学性质,发现该羰基还原酶催化还原反应的最适温度为30℃,最适还原反应的pH为6.0,在pH4.5-7.0的酸性范围内仍能够保持原来80％以上的活力。酶对底物OPBE的最大反应速率Vmax是18.7μmol/(min-mg)、Km值是0.319 mmol/L,对辅酶NADPH最大反应速率Vmax是14.9μmol/(min.mg)、Km值是0.306 mmol/L。该酶具有较高的底物特异性,对含有苯基的酮酯类底物具有较高的不对称还原活力。同时研究发现Mn2+、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇对该酶的酶活有不同程度的促进作用;重金属离子、能够与还原性硫醇基团结合的金属离子、抑制剂、还原剂、有机溶剂和表面活性剂对酶活有抑制作用。利用该酶催化不对称还原OPBE生成(R)-HPBE,4 h后e.e.值和产率分别为100％和84％。经LC-MS-MS分析比对,酶蛋白中一个肽段的氨基酸序列在NADP-dependent isocitrate dehydrogenase中的覆盖率约为2.4％,因此,目的蛋白与NADP-dependent isocitrate dehydrogenase有一定的相似性。　　 以Candida krusei SW2026基因组为模板,以蛋白测序结果为依据设计引物,PCR扩增得到了目的基因的部分序列,将PCR产物连接pMD18-T载体并测序得到长度为677 bp的基因序列,从该序列的第二个碱基开始共编码225个氨基酸。并通过NCBI中Blast比对初步验证了其正确性。