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持续的高血糖是引起糖尿病并发症的一个重要因素，在高血糖环境中，还原性糖如葡萄糖与循环蛋白或结构蛋白通过共价交联，发生非酶糖化作用形成糖化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)。这些共价化合物与组织血液中多种细胞成份密切相关，其在各种组织蛋白上的过度沉积可引起老龄化和糖尿病的多种并发症。 糖化终术产物受体(Receptor for advanced glycation end products,RAGE)是近年来被明确称为细胞表面分子免疫球蛋白超家族新成员的AGEs的特异性受体，可在多种细胞表面表达。但是关于视网膜微血管内皮细胞和周细胞RAGE的表达尚在研究阶段，深入研究RAGE的特性和寻找有效阻断该受体的方法，有助于系统地探索糖化终末产物参与糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)的病理机制。 本实验室在前期工作中通过免疫组化观察到糖尿病大鼠视网膜血管上AGEs的沉积，而且体外孵育的AGE-BSA和AGE-RSA能够诱导正常大鼠发生类糖尿病视网膜血管病变的发生。本研究应用选择性培养基进行牛视网膜微血管内皮细胞和周细胞的原代培养，观察微血管细胞上RAGE的表达以及针对RAGE序列的反义寡核苷酸的干预作用；并同时观察了随糖尿病病程的延长，体内RAGEmRNA表达的变化以及氨基胍是否具有干预作用。 第一部分 糖化终末产物受体参与糖尿病视网膜病变机制的研究 首先应用PCR方法，分别观察2wk，4wk和8wk糖尿病大鼠以及氨基胍干预8wk后视网膜RAGEmRNA的表达。本实验发现随着糖尿病病程的延长，4wk组糖尿病大鼠视网膜上RAGEmRNA的表达(relative IOD=0.3350+0.0696)较2wk组(relative IOD=0.2134+0.0554)明显升高(P＜0.01)，但其增加不是无限制的，8wk组视网膜上RAGEmRNA的表达(relative IOD=0.2956+0.0255)未见增加，与4wk组比较无统计学意义(P＞0.05)。无论微血管组织或细胞表面的受体，都可能达到一定的饱和，所以在8wk病程糖尿病大鼠组，RAGEmRNA的表达与4wk组比较未见明显的升高。正常对照组在整个实验过程中，其RAGEmRNA均未见明显改变，但可见弱表达，说明正常组织中也存在RAGEmRNA的表达，持续的高血糖可能促进RAGEmRNA表达水平的上调，从而加强AGE~RAGE的相互作用，促进DR的发展。本研究观察了swk病程组糖尿病大鼠给予氨基肌治疗后，RAGEmRNA的表达(relative IOD=0.1237士0.0225)较未予以氨基肌治疗组明显下降(:elative IOD=0.2956士0.0255)(P<0.01)，与正常对照组(relative IOD=0.1460士0.0282)和氨基肌治疗对照组(relative IOD=0.1055士0.0218)比较无明显差异(P>0.05)，推测氨基肌可能直接或间接调节细胞AGES受体基因的表达，从而减少AGE-RAGE相互作用可能导致的组织病理改变，提示氨基肌和其他AGES抑制剂在防治糖尿病慢性并发症中的重要意义。 其次本实验应用牛视网膜微血管进行消化分离，采用含10%人血清、100协g/ml肝素(Heparin)的nulbeeeo改良的Eagle培养基(Dulbeeeo，5 ModifiedEagle’s Medinm，DMEM)和含20%胎牛血清的DMEM培养基分别选择性培养内皮细胞(Bovine Retinal Endothelial Cells，BREC)和周细胞(Bovine RetinalPericytes，BRP)。通过荧光显微镜观察乙酞化低密度脂蛋白Dll一Ac一LDL吞噬情况和应用Von Willebrand因子抗体免疫组织化学鉴定内皮细胞;以及a一平滑肌肌动蛋白抗体免疫组织化学鉴定周细胞。选择性培养基的应用使得内皮细胞和周细胞的纯度达到98%以上，并能连续传代。BREC早期似小鲤鱼状聚集在微血管碎片周围，呈片状鹅卵石样单层生长，存在接触性抑制;周细胞多散布在距血管碎片稍远处，形状不规则，呈无接触性抑制的生长。BREC可吞噬Dil一Ac一LDL，细胞浆内有荧光表达;消化传代后BREC中Von Wlllebrand因子表达阳性，而a-平滑肌肌动蛋白表达阴性;BRP的a一平滑肌肌动蛋白表达阳性，而Von Wilfebrand因子表达阴性。本实验通过选择性培养基的应用和培养皿的处理，可分别获得较高纯度的内皮细胞和周细胞，简单并具有良好的重复性，无需额外的步骤来去除内皮细胞中混杂的周细胞。 本实验取第二代细胞应用多克隆抗R了、GE抗体，检测到BREC和BRP有糖化终末产物受体的表达，内皮细胞和周细胞均为浆表达，核无染色。原代培养的BREC和BRP在传代至第二代时提取BREC和BRP的总RNA，经Rl飞PCR扩增出386bp的条带。确定了正常生物体内存在RAGE的固有基因，为进一步选择性阻断糖化终末产物的致病途径提供有力的证据。 同时，本实验取终浓度somg/ml BsA，soommol/LD一Glucose，于37oC孵箱内避光孵育12wk，制备外源性AGEs，经sePhaeryls一300层析纯化，SDS一队GE蛋白电泳鉴定AGE一BSA和CO~assie法测定蛋白浓度。观察体外孵育的AGE一BSA对BREC和BRP的毒性作用。发现随着AGEs剂量的增加，细胞被抑制呈上升趋势，说明AGEs对B既c和BRP的抑制与浓度呈正相关。500林留mlAGE一BSA抑制内皮细胞为空白对照组的72.8月5.9%，抑制周细胞为空白对照组的64.8士9%。本实验还发现低浓度AGES对内皮细胞有一定促增生作用，但与空白对照组比较无统计学意义。应用相差倒置显微镜观察500卜g/ml AGE一BSA和BSA