1.研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的神经系统退行性疾病。AD典型的组织病理学改变为主管记忆和情绪的脑区存在神经炎性斑和神经原纤维缠结。神经炎性斑以β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)为核心,而神经原纤维缠结由过度磷酸化的微管tau蛋白于神经元内高度螺旋化形成。大量研究证实,神经炎症在AD的病理机制中起重要作用。小胶质细胞是介导大脑炎症过程的主要细胞,参与Aβ的清除过程。但当Aβ水平升高时,小胶质细胞的异常激活可导致持续的炎症反应从而损伤神经元。心理应激是AD发病的主要危险因素之一,与AD的发生、发展密切相关。流行病学研究证实,创伤后应激障碍或抑郁症患者会出现痴呆症状甚至是临床典型的AD,其原因被认为是AD患者体内糖皮质激素水平升高所致,而糖皮质激素是经典的应激激素,提示AD患者存在心理应激。动物实验表明,下丘脑-垂体-肾上腺轴与前额叶皮质和海马的AD病理改变有关,慢性不可预期性应激(chronic unpredictable stress,CUS)可显著增加动物模型血清皮质酮水平和脑内淀粉样前体蛋白表达。此外,慢性应激包括束缚/孤立应激可增加小鼠大脑中Aβ40和Aβ42表达,加速淀粉样斑块的形成,损害小鼠的学习和记忆。研究证实,小胶质细胞存在与细胞毒性相关的经典M1激活模式和吞噬/保护转换激活模式(M2激活模式)。M1型激活时,干扰素调节因子(interferon-regulatory factor,IRF)家族成员IRF5激活炎性细胞因子编码基因产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-12。M2型激活由IRF4环磷酸腺苷反应元件结合蛋白控制,使小胶质细胞活化分泌IL-4、IL-10和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),后者促进体液免疫反应并调节M1型小胶质细胞介导的反应,具有抑制炎症的作用。心理应激导致小胶质细胞M1型激活伴随各种炎性细胞因子分泌增加,如TNF-α,IL-1β、IL-6、IL-12和IL-18,这种激活通常与吞噬能力下降有关,并伴有iNOS的高表达。而M2型激活时抑炎细胞因子IL-4、IL-10、IL-13和TGF-β的分泌增多与吞噬能力增加有关。研究表明,不同类型的应激,如CUS、束缚应激等,均可诱导小胶质细胞向炎性细胞因子分泌增多而吞噬能力下降的M1型活化。但社会心理应激导致的小胶质细胞激活是否对其清除Aβ的能力产生影响尚不十分清楚。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)是一组调控基因表达的配体诱导核受体蛋白,广泛存在于人体各器官,在不同的物种中已经发现其具有3种亚型,分别为PPARα、PPARβ及PPARγ。在三种亚型中,PPARγ在中枢神经系统中表达量最高,在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中均有表达。PPARγ与应激调节和小胶质细胞表型的转化有关,其可通过诱导小胶质细胞M2表型以减轻Aβ蛋白的神经炎症毒性作用。PPARγ激动剂吡格列酮对慢性温和应激所致的抑郁样行为具有治疗作用,其机制与吡格列酮激活PPARγ从而诱导小胶质细胞M2型激活相关。中药淫羊藿提取物淫羊藿苷被证实具有广泛的抗氧化、抗菌、抗炎等作用。以往有研究提示,淫羊藿苷可明显减轻AD模型的认知功能障碍、减轻缺血所致的神经元损伤。另有研究证实,淫羊藿苷可通过激活PPARγ减轻大鼠的炎症反应。但是,淫羊藿苷能否通过上调PPARy改善阿尔茨海默病的症状和减轻病理改变尚需研究证实。2.研究目的2.1慢性不可预期性温和应激对小鼠海马、前额叶小胶质细胞M1激活表型标志物 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 TLR4-NF-κB 通路的影响。2.2束缚/孤立应激对APP/PS1小鼠阿尔茨海默病症状和海马、前额叶小胶质细胞激活表型、Aβ沉积的影响及淫羊藿苷能否通过上调PPARγ改善阿尔茨海默病症状及病理改变。2.3脂多糖刺激和淫羊蕾苷处理对BV2小胶质细胞表型和PPARy表达的影响。3.材料与方法3.1实验动物和细胞系的分组与处理3.1.1实验一:30只7-8周龄的健康雄性C57BL/6小鼠,适应性喂养一周后,随机分成三组:对照组(control,Ctr)、慢性不可预期性温和应激组(chronic unpredictable mild stress,CUMS)、慢性不可预期性温和应激+TAK-242 组(CUMS+TAK),每组10只小鼠。对小鼠采用为期21天的慢性不可预期性温和应激,以建立小鼠心理应激模型,干预手段为腹腔注射TLR4抑制剂TAK-242。在造模和干预结束后,依次进行行为学测试、取材及后续的分子生物学实验。3.1.2实验二:30只3月龄的健康雄性APP/PS1小鼠,适应性喂养一周后,随机分成三组:对照组(Ctr)、束缚/孤立应激组(restraint/isolation stress,RIS)、束缚/孤立应激+淫羊藿苷(icariin,ICA)组(RIS+ICA),每组10只小鼠。束缚/孤立应激组和束缚/孤立应激+淫羊藿苷组小鼠采用28天束缚/孤立应激建立阿尔茨海默病小鼠心理应激模型,束缚/孤立应激+淫羊藿苷组小鼠应激结束后再接受淫羊藿苷灌胃给药6个月。束缚/孤立应激结束后,所有动物进行行为学测试。淫羊藿苷灌胃给药结束后,所有动物进行水迷宫测试、动物取材和分子生物学实验。3.1.3实验三:BV2细胞系培养于由90%高糖型DMEM+10%FBS+青霉素100 U/ml+链霉素100 ug/ml组成的培养基中,设置对照组(Ctr)、脂多糖组(lipopolysaccharide,LPS)、脂多糖+淫羊藿苷低浓度组(LPS+ICA5)及脂多糖+淫羊藿苷高浓度组(LPS+ICA10)4组,采用脂多糖刺激作为BV2细胞M1型激活模型,同时给予低浓度(5 μM)和高浓度(10 μM)淫羊藿苷处理。造模结束后进行分子生物学实验。3.2慢性不可预期性应激应激刺激包括:45°倾斜鼠笼12 h,噪音刺激1 h(1500Hz,92 dB),24h昼夜颠倒,禁食8 h,禁饮8 h,不可回避的足部电击(电压为50 mV,每次电击10 s,每分钟电击一次,持续15 min),水平震荡20 min。应激期间每天随机给予一种刺激且与前一天不同,每种刺激给予3次。3.3束缚/孤立应激每只小鼠单独束缚于束缚筒中(束缚筒口径3.0 cm,长度10.0 cm),每天应激刺激6 h,应激期间禁食、禁饮。3.4药物的使用3.4.1实验一:慢性不可预期性温和应激+TAK-242组小鼠在慢性不可预期性温和应激期间给予TAK-242 3 mg/kg预处理,于应激刺激开始前30 min通过腹腔注射给药。药物注射时间均为21天。为平衡误差,对照组和慢性不可预期性温和应激组小鼠以相同方式给予相同体积的80%聚乙烯二醇400。3.4.2实验二:束缚/孤立应激+淫羊藿苷组小鼠在4-10月龄每天给予淫羊藿苷60 mg/kg灌胃给药,共给药6个月。为平衡误差,对照组、束缚/孤立应激组小鼠以相同方式给予相同体积的双蒸水。3.4.3实验三:取生长状态良好的BV2细胞,实验前1h换为无血清DMEM/F12培养基。1 h后,脂多糖组和两药物治疗组换为含LPS(1 ug/m1)的无血清培养基分别孵育0.5 h,然后,分别于淫羊藿苷低浓度组和高浓度组中加入淫羊藿苷使其终浓度分别为5μM及10 μM,培养6h。3.5行为学测试分别采用糖水偏好实验、旷场实验和高架十字迷宫实验评估小鼠的快感缺失程度,自主活动和探索行为及焦虑样行为。采用Y迷宫和Morris水迷宫实验检测小鼠的空间学习和记忆能力。3.6 放射免疫法检测每组随机选取6只C57BL/6小鼠麻醉后心脏穿刺取血,离心取血清,采用放射免疫法检测血清皮质酮水平,具体操作严格按照放射免疫分析试剂盒说明书进行。3.7免疫组织/细胞化学法检测3.7.1实验一:C57BL/6小鼠于行为学实验结束后,每组随机选取4只麻醉进行脑组织样本制备。利用免疫组织化学染色检测海马及前额叶NF-κB的分布与表达。3.7.2实验二:APP/PS1小鼠于水迷宫实验结束后,各组随机选取4只动物麻醉进行脑组织样本制备。利用免疫组织化学染色检测海马和前额叶Aβ1-42、Iba-1和iNOS的分布与表达。3.7.3实验三:BV2小胶质细胞在造模结束后用1%多聚甲醛固定,利用免疫细胞化学法检测iNOS的分布与表达。3.8酶联免疫吸附实验检测提取实验动物脑组织或细胞总蛋白,测定总蛋白浓度,按试剂盒要求进行标准品的稀释与加样,使得每标准品孔中含蛋白标准品50μl,设置空白孔,于空白孔中加入40 μl样品稀释液,其他待测样品孔中加入40μl样品稀释液及10 μl待测样品。置于37℃恒温箱孵育,以稀释好的洗涤液洗涤。拍干后加入酶标试剂50 μl,置于37℃恒温箱孵育,以稀释好的洗涤液洗涤。除空白孔外,每孔依次加入显色剂A、显色剂B各50 μl,37℃避光孵育。孵育后将终止液50 μl加入各孔,在酶标仪450 nm波长下测定各孔的吸光度,根据标准曲线计算出各待测样品的所测蛋白表达浓度。3.9免疫印迹法检测NF-κB或PPARy表达提取实验动物脑组织或细胞总蛋白,测定总蛋白浓度。蛋白样品加热变性后,经电泳、转膜、封闭后,分别孵育不同目的蛋白或内参蛋白一抗4℃过夜,洗涤后加二抗于室温孵育1 h。再次洗涤后以化学发光法显影,使用Image J 14.0软件分析各条带的灰度值。4.结果4.1实验一结果慢性不可预期性温和应激对C57BL/6小鼠行为学测试结果及海马、前额叶小胶质细胞M1激活表型标志物IL-1β、IL-6、TNF-α和TLR4-NF-κB通路的影响4.1.1慢性不可预期性温和应激可导致C57BL/6小鼠在行为学测试中表现出明显的抑郁样行为和学习记忆功能损害。4.1.2慢性不可预期性温和应激可导致C57BL/6小鼠海马及前额叶M1激活表型标志物IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB表达升高。4.1.3 TLR4抑制剂TAK-242可显著改善C57BL/6小鼠的抑郁样行为和学习记忆功能损害,并可使IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB的表达趋于正常。4.2实验二结果束缚/孤立应激对APP/PS1小鼠阿尔茨海默病症状和海马、前额叶小胶质细胞激活表型、Aβ沉积、PPARγ表达的影响及淫羊藿苷的治疗作用4.2.1束缚/孤立应激可导致4月龄APP/PS1小鼠明显的抑郁样行为及10月龄APP/PS1小鼠明显的学习记忆功能损害。4.2.2束缚/孤立应激可导致10月龄APP/PS1小鼠海马、前额叶小胶质细胞M1型激活增加、Aβ沉积增加、PPARy表达减少。4.2.3中药提取物淫羊藿苷可显著改善10月龄APP/PS1小鼠的学习记忆功能损害,并可逆转10月龄APP/PS1小鼠海马、前额叶小胶质细胞M1型激活增加、Aβ沉积增加、PPARy表达减少。4.3实验三结果 脂多糖刺激和淫羊藿苷处理对BV2小胶质细胞表型和PPARy表达的影响4.3.1 1 ug/ml脂多糖刺激可导致BV2小胶质细胞IL-6、TNF-α表达水平及iNOS阳性细胞比例显著升高及TGF-β1的表达降低。4.3.2与对照组和LPS组相比,高浓度淫羊藿苷处理显著上调BV2小胶质细胞PPARγ表达;与LPS组相比,高浓度淫羊藿苷处理显著降低BV2小胶质细胞IL-6、TNF-α表达水平及iNOS阳性细胞比例,升高TGF-β1的表达水平;与LPS组相比,低浓度淫羊藿苷处理显著降低IL-6、TNF-α表达水平及iNOS阳性细胞比例,升高TGF-β1的表达水平。5.结论5.1心理应激激活TLR4-NF-κB炎症信号通路,导致C57BL/6小鼠抑郁样行为、空间记忆能力损害,海马及前额叶M1型小胶质细胞标志物表达水平升高。5.2心理应激可通过抑制PPARγ的表达,导致APP/PS1小鼠抑郁样行为、更为严重空间记忆能力损害,海马及前额叶M1型小胶质细胞标志物表达水平升高及Aβ病理改变加重。5.3淫羊蕾苷可通过上调PPARγ诱导小胶质细胞的表型转化,改善心理应激所致的阿尔茨海默病症状及病理改变加重,为阿尔茨海默病的治疗提供新的可能。5.4高浓度淫羊藿苷处理可上调BV2小胶质细胞PPARy的表达并减轻脂多糖刺激所致的BV2小胶质细胞M1型激活。