天然免疫系统通过表达不同的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)特异性地识别入侵的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),发挥级联信号转导作用,从而达到抗病毒免疫防御作用。MDA5和NALP3分别为模式识别受体维甲酸诱导基因I样受体家族(Retinoic acid-inducible gene I-like receptors, RLRs)家族和核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors, NLRs)亚家族中的重要成员。它们能够识别RNA病毒,并调节细胞因子,发挥非特异抗病毒作用。J亚群禽白血病(Avian leucosis virus subgroup J, ALV-J)是近年来受到广泛关注的禽白血病的一种,感染该病毒的鸡往往会发生免疫抑制,导致机体的免疫应答受阻。本研究为了解鸡模式识别受体NALP3和MDA5在ALV-J感染细胞中的作用,本研究通过在对一株ALV-J野毒株的分离、鉴定及其env基因遗传进化分析的基础上,建立了检测ALV-J病毒感染DF-1细胞诱导NALP3和MDA5的表达的实时荧光定量RT-PCR方法,为进一步探讨NALP3和MDA5受体抗ALV-J感染的免疫通路奠定基础。首先,本实验室从安徽省合肥市某蛋鸡场疑似感染ALV-J的鸡群中分离并鉴定了l株ALV-J.患鸡精神沉郁,明显消瘦,皮肤苍白。经过剖检,发现肝脏、脾脏、卵巢明显肿大,其中肝脏表面有大量白色肿瘤小结节。采用组织研磨、过滤方法,将肝脏病料液接种鸡胚原代成纤维细胞和DF-1细胞系,提取培养7d细胞的总RNA和DNA,利用H5/H7特异性引物和env基因引物进行PCR扩增后,分别获得545bp和2106bp大小的目的条带,将两个片段分别插入pMD-18T载体中,转化于E.coilDH5a大肠杆菌并挑取阳性克隆进行测序。结果表明,本实验室成功分离了一株引发多种组织肿瘤的临床分离毒株,命名为AJV-HF211=通过DNA Man软件对国内外已报道的14株ALV-J进行同源性分析,结果表明,AJV-HF211毒株与这14株同源性为88.8%-94.0%,其中与国内广东分离株GDll09同源性为94.0%,同源性最高,亲缘关系最近。AJV-HF211毒株与英国原毒株HPRS-103的同源性仅为89.3%,不在同一分支,亲缘关系相对较远,表明AJV-HF211在遗传进化过程中存在较大的变异。其次,本研究通过设计NALP3和MDA5两种受体的特异性引物,建立SYBR Green I实时荧光定量检测NALP3和MDA5受体转录水平的方法,并用该方法检测了AJV-HF211毒株感染DF-1细胞后不同时间段内两种受体mRNA的转录水平。结果发现,与未感染的对照细胞相比,AJV-HF211毒株感染的DF-1细胞内NALP3和MDA5基因的转录水平均有不同程度的增加。其中,NALP3在病毒感染后第l-3d表达量逐步上升,在第4d时达到顶峰,而第5-7d表达量有波动,在5d后NALP3的表达量急剧下降。而MDA5在病毒感染组第1-3d时呈缓慢上升趋势,在第4d时表达量下降,第5-6d时表达又呈上升趋势,在第6d时达到最高值,而在第7d时表达量下降。提示,MDA5和NALP3受体在ALV-J感染过程中发挥重要作用,相关机理需要进一步验证。