妊娠糖尿病能导致先天畸形的发病率增加,其主要原因是胚胎发育早期母体的高血糖状态抑制器官发育,从而引发涉及多种系统的先天性畸形,如神经系统、心血管系统、消化系统、泌尿生殖系统及骨骼系统等。在诸多畸形中,以神经管畸形(neural tube defects,NTDs)最为常见.前期研究发现,在病变的神经管上皮可以观察到过多的凋亡细胞,因此提出母体高血糖状态所引起的神经管上皮细胞过度凋亡是导致NTD发生的主要原因。在胚胎发育过程中,神经上皮主要由神经前体细胞(neural progenitor cells, NPCs)组成。NPCs过度凋亡可干扰神经管的正常发育,从而引发NTDs.然而,高糖是如何引起NPCs过度凋亡的,其中的关键分子是什么,信号传导通路是如何调节的,至今仍不十分清楚。凋亡是一个受基因调控的选择性细胞死亡过程,蛋白激酶通过磷酸化关键蛋白而调节凋亡的早期阶段。以往的研究发现,蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)家族在哺乳动物神经胚形成过程中发挥重要作用,并且PKC激活与妊娠糖尿病胚胎畸形的发生密切相关。PKC家族是一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,在细胞生长、分化及凋亡过程中发挥重要作用。基于其结构和激活机制的不同,PKC家族可以分为3类：即经典型PKC(Conventional PKC, cPKC),包括α,βⅠ,βⅡ及γ,激活时需要钙离子和甘油二酯(diacylglycerol,DAG)；新型PKC(novel PKC, nPKC),包括δ,ε,θ及μ,激活时不需要钙离子,但需要DAG；非典型PKC(atypical PKC,aPKC),包括ζ及λ,激活时既不需要钙离子,也不需要DAG。由于PKCδ在多种因素所致的凋亡中发挥重要作用,因而受到越来越多的关注。在H2O2、紫外线、抗癌药或活性氧(reactive oxygen species,ROS)等的刺激下,PKCδ在不同的细胞中均发挥促凋亡作用。PKCδ激活从而引起凋亡的分子机制主要包括酪氨酸位点磷酸化及PKCδ转位。PKCδ酪氨酸磷酸化通常发生在凋亡的早期；基于刺激信号的差异,PKCδ可以转移到质膜、线粒体、高尔基复合体、内质网及细胞核等不同部位。我们前期研究发现,非受体酪氨酸激酶c-Abl在高糖诱导的NPCs凋亡过程中发挥重要作用。高糖诱导NPCs凋亡过程中,c-Abl尤其是核中的c-Abl表达上调。多项研究表明,DNA损伤及氧化应激时,c-Abl通过其SH3结构域与PKCδ结合并将PKCδ上的酪氨酸残基磷酸化。因此,在PKCδ激活导致的细胞凋亡中,c-Abl可能是一种关键的辅助因子。同时,越来越多的研究发现,p53介导的凋亡在NTDs的发生中起重要作用。在野生型的小鼠胚胎中,抑制p53能引起神经管上皮细胞凋亡减少,在p53基因敲除(p53-/-)胚胎中,不能检测到神经上皮细胞的凋亡。此外,大量研究发现DNA损伤后能同时激活p53和c-Abl。以上研究资料提示,p53可能是高糖诱导NPCs凋亡过程中,PKCδ-c-Abl通路上的关键因子。在本研究中,我们首先建立了高糖诱导NPCs凋亡模型,并从在体及体外两方面对高糖诱导NPCs凋亡时PKC8的作用及作用机制进行了研究。结果表明：c-Abl可以结合并磷酸化PKCδ酪氨酸残基；随后,PKCδ-c-Abl复合物进入细胞核,从而引起核中p53的聚集,进而引起NPCs凋亡。一、高糖诱导NPCs凋亡模型的建立及凋亡的检测1.体内实验：选用8周雌性Swiss小鼠,连续3天腹腔注射链脲霉素(streptozotocin,STZ,75mg/kg),7天后检测小鼠血糖水平,血糖值高于16.7mmol/l (300 mg/dl)为糖尿病小鼠。将雌性糖尿病小鼠与健康雄性小鼠合笼交配,次日查到阴栓定为受精后胚胎0.5天(E0.5),孕11.5天(E11.5)时剖腹取胎,解剖显微镜下检查胚胎发育情况,部分小鼠出现明显的颅脑神经管未闭合现象。E11.5天胚脑切片TUNEL染色显示：GDM小鼠胚胎腹侧端脑(ventral telencephalon zone, VZ)部位神经上皮细胞凋亡数量明显高于正常对照组。2.体外实验：于小鼠妊娠后11.5天应用体视显微镜成功分离胚胎神经管前端脑泡,经机械吹打后,获得细胞悬液,接种于无血清干细胞培养基,获得神经球。取第二代神经球,经胰酶消化后接种于多聚赖氨酸处理的培养皿中,获取单层NPCs。为检测高浓度葡萄糖对体外培养NPCs的作用,实验组用含35mM葡萄糖的培养基培养,对照组用含5mM葡萄糖的培养基培养。为了进一步排除渗透压因素可能造成的细胞凋亡,甘露醇组用含有5mM葡萄糖及30mM甘露醇的培养基。24h及48h后,DAPI染色检测凋亡,结果显示与对照组及甘露醇组相比,高糖组NPCs细胞核固缩,荧光亮度较强,说明凋亡细胞明显增多。对照组24小时及48小时NPCs凋亡率分别为5%±1.3%及7%±1.9%,甘露醇组的凋亡率分别为8%±2.3%及9%±2.1%,而高糖组的凋亡率分别为28%±3.9%和35%±4.2%。上述结果提示,无论是体内及体外,高糖均能诱导NPCs凋亡。二、高糖诱导NPCs凋亡中,PKCδ激活及其激活机制的研究首先应用基于免疫沉淀的激酶活性分析方法在体检测了PKCδ的激活情况,结果显示与对照组相比,GDM组胚胎脑组织中PKCδ活性明显增强。与在体结果相一致,体外NPCs培养同样也检测到高糖诱导的PKCδ激活。为进一步验证这一现象,我们在高糖诱导组中加入了5μM PKCδ的选择性抑制剂]rottlerin,结果显示rottlerin可以抑制高糖诱导的NPC凋亡。既然高糖诱导NPCs凋亡过程中,PKCδ被激活,那么其激活机制是什么?为此,我们分别应用反转录PCR (RT-PCR)及免疫印迹的方法检测了实验组及高糖组NPCs中PKCδ的表达,结果显示高糖诱导9,16,24小时后,PKCδ的mRNA及蛋白水平并未发生明显变化,上述结果表明,高糖诱导PKCδ激活主要是通过酶促机制而非通过mRNA或蛋白表达上调所致。以往研究表明,酪氨酸磷酸化对PKCδ的激活发挥重要作用,因此我们检测了高糖诱导下,PKCδ酪氨酸磷酸化水平。结果显示,未用高糖刺激时,仅观察到极低水平的酪氨酸磷酸化；高糖诱导后3小时,酪氨酸磷酸化水平开始升高,在6小时达到高峰,此后,酪氨酸磷酸化水平又逐步降低。由于STZ诱导的GDM小鼠很难判断血糖增高的确切时间,因此,为了在体进一步验证高糖诱导下的PKCδ酪氨酸磷酸化,我们应用了的葡萄糖腹腔注射高糖模型。结果显示,孕鼠葡萄糖注射6小时后,胚胎脑组织中酪氨酸磷酸化水平明显升高。有研究表明,不同的凋亡刺激可以使PKCδ转移至不同部位,如细胞膜、线粒体、高尔基复合体、细胞核等,从而发挥作用。为进一步检测高糖能否引起PKCδ转位,我们应用免疫荧光的方法检测高糖诱导前后PKCδ在NPCs中的分布。结果显示,在对照组,PKCδ在胞浆及胞核中均有分布；高糖组,PKCδ主要分布于细胞核。核浆蛋白分离免疫印迹结果显示：高糖诱导后,细胞核中PKCδ水平逐渐增加,而细胞浆中PKCδ水平逐渐降低。在葡萄糖腹腔注射高糖模型中,同样观察到葡萄糖注射12及24小时后,PKCδ的核浆转位现象。上述结果表明,高糖诱导下,PKCδ激活,其激活的主要机制包括两方面,酪氨酸残基磷酸化及PKCδ从细胞浆转移至细胞核。三、PKCδ在高糖诱导NPCs凋亡中信号通路的实验研究以往的研究表明在DNA损伤及氧化应激时,非受体酪氨酸激酶c-Abl与PKCδ相互作用。我们前期研究结果也发现高糖诱导下,NPCs细胞核中c-Abl表达上调。我们研究发现,高糖诱导下,PKCδ及c-Abl在细胞核中表达呈现时间一致性。为此,我们应用免疫共沉淀的方法进一步证实二者之间的相互关系。结果显示,高糖诱导3小时后,胞浆中可以检测冲PKCδ及c-Abl的相互结合。细胞核中二者的结合主要发生于高糖诱导后9小时。应用葡萄糖腹腔注射高糖模型同样检测到PKCδ及c-Abl的相互结合。我们又应用RNA干扰的方法,进一步验证二者的相互关系。结果显示,当c-Abl表达降低后,细胞核中PKCδ的量也明显减少。同样,当PKCδ表达下调后,细胞核中c-Abl的表达也显著降低。作为一种非受体酪氨酸激酶,c-Abl在H2O2、放射线、紫外线及抗肿瘤药等作用的不同细胞模型中均检测到可以酪氨酸磷酸化PKCδ。那么高糖诱导的PKCδ酪氨酸磷酸化是否是c-Abl所介导的呢?结果显示c-Abl RNA干扰后,PKCδ酪氨酸磷酸化水平降低。应用c-Abl抑制剂STI571预处理NPCs,同样能降低PKCδ酪氨酸磷酸化。这些结果说明,c-Abl可能通过直接或间接作用酪氨酸磷酸化PKCδ。p53介导的凋亡在胚胎异常发育中起关键作用。我们前期研究结果也显示高糖诱导下,p53在细胞核中表达增加。鉴于此,我们进一步检测了c-Abl-PKCδ的相互结合与p53的关系。结果显示,PKCδ或c-Abl RNA干扰后,细胞核中p53的表达下调。DAPI染色结果显示,PKCδ或c-Abl RNA干扰后,NPCs凋亡明显减少。这些结果表明高糖诱导的NPCs凋亡是通过p53依赖的、PKCδ及c-Abl参与的信号通路。结论：在本研究中,我们分别采用在体及体外细胞培养的方法分别检测了高糖诱导下NPCs凋亡。研究结果发现在这一过程中,c-Abl磷酸化PKCδ酪氨酸残基,PKCδ-c-Abl复合物从胞浆转移到细胞核,最终引起细胞核中p53的聚集。本研究揭示了PKCδ-c-Abl在高糖诱导NPCs凋亡中的作用及作用机制,为GDM致NTDs在分子水平上的机理探索和防治研究提供了重要的实验依据。