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目的:本研究运用实时细胞分析技术（Real-Time Cellular Analysis,RTCA）和四甲基偶氮唑盐比色法（MTT Assay,MTT）检测肠道微生物的细胞毒性,为开展肠道微生物细胞毒性研究,提供更准确、简单及方便的检测方法。并制备肠道潜在益生菌——嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila,Akk）Amuc-1100蛋白单克隆抗体,为Akk细菌的检测与鉴定奠定基础。方法:本研究选取肠道菌群中较为常见的益生菌——干酪乳杆菌（L.casei）及致病菌——肠出血性大肠杆菌（EHEC）作为研究对象,分别制备两种细菌的菌液（MOI=200）、菌体裂解液（MOI=200）以及上清液（25%）,将其感染HT-29和LoVo细胞,采用MTT法检测细菌对细胞活力的影响,及RTCA法观察不同细胞浓度的增殖曲线变化,并检测细菌对细胞的校正细胞指数（NCI）。另外优化Akk细菌的培养条件,构建Akk菌外膜Amuc-1100蛋白表达株,在IPTG诱导下,克隆、表达和纯化该蛋白,并以Amuc-1100蛋白免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体。结果:RTCA法选取细胞浓度为6×104个/孔,种植12-14 h为最佳条件检测细胞毒性,其中活菌和裂解液检测结果与MTT法一致:L.casei活菌、菌体裂解液对上述HT-29和LoVo细胞均无明显毒性（NCI>1.5）,显微镜下观察孔覆盖率>95%;EHEC活菌对细胞均有明显毒性（NCI趋于0,且P<0.01）,其裂解液对HT-29细胞有毒,NCI曲线呈明显下降趋势（P<0.01）,但对LoVo细胞的NCI值无明显影响,表明EHEC菌体内的结构蛋白及分泌蛋白对LoVo细胞无毒性作用。但在上清实验中,MTT法检测EHEC对LoVo细胞无明显毒性,通过显微镜观察及RTCA检测发现细菌上清液（TSB培养基）对LoVo细胞的黏附及形态有显著影响,细胞的NCI值波动大,说明MTT法检测结果有误,忽略了背景因素带来的干扰。以上结果表明,RTCA法能实时、准确地反应出细菌活菌、裂解液及上清液对细胞活力的影响。另外优化了Akk细菌的培养条件,采用改良BHI培养基使得细菌的生长时间由2d3d缩短为18h24h,菌液OD600值由0.751可升至1.869。成功构建了Amuc-1100蛋白表达株,其中pET28a-Amuc1100-BL21（λD3）,在IPTG浓度为1.0 mmol/L,于20℃,150 rpm摇床中诱导10 h时蛋白表达量最大,蛋白分子量大小为46 KDa;pET32a-Amuc1100-BL21（λD3）,在IPTG浓度为0.6 mmol/L,于16℃,110 rpm摇床中诱导10 h时蛋白表达量最大,蛋白分子量大小为62KDa。经SDS-PAGE电泳鉴定两载体所构建的融合蛋白均为可溶性表达,并通过镍柱纯化得到该蛋白。以Amuc-1100蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得1C2、1E4、2F2三株阳性克隆,经抗体分型试剂盒测定均为IgA型。取阳性克隆制备腹水,通过ELISA检测单抗腹水效价为1:12800。结论:本研究采用RTCA法检测肠道微生物的细胞毒性,该方法简单、全自动、可动态实时监测,适用于细菌细胞毒性检测;另外成功制备得到Amuc-1100蛋白单克隆抗体,为Akk细菌的检测与鉴定奠定基础。