引言原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种高度异质性、癌性血管丰富的恶性实体肿瘤,早期诊断率低。根治性切除或肝脏移植后大部分病例在2年内形成肝内复发或肝外转移,5年生存率较低。中晚期患者由于受基础肝功能的影响,目前尚缺乏反应率高且相对安全的治疗措施。因此肝癌的综合治疗策略亟待进一步研究及补充。传统的抗内皮细胞依赖性血管(endothelial dependent vessel,EDV)生成在实体肿瘤治疗中的不理想,提示了可能存在另外一种相对独立的微血管系统参与肿瘤血供。拟态血管(vasculogenic mimicry,VM)是由肿瘤细胞独立形成的、参与肿瘤血供及转移的微血管结构,它的形成是肿瘤细胞自身塑性改变以及肿瘤细胞与局部微环境相互作用的结果,多种肿瘤基因及血管生成调节基因参与其中。恶性肿瘤中VM的形成多与不良预后密切相关。Notch基因目前发现4种(Notch1-4)亚结构,是哺乳动物胚胎发育过程中重要的调控基因。在胚胎后的肿瘤形成及进展、组织纤维化、血管生成中发挥重要作用。Notch基因在黑色素瘤及乳腺癌的血管拟态中均发挥重要作用。而关于Notch1在肝癌血管拟态形成中的作用及机制,目前鲜有报道。肝癌中医称为肝积,属于现代中西医结合理论中的络病范畴。肝癌的血管生成是一种病络的综合表现,其病机要素为“虚、瘀、毒”。病络是肝癌生长和转移的主要途径。理论上讲肝癌的血管拟态亦是一种病络。根据“辛以通络”原则,辛药具有活血祛瘀、解毒散结功效的可发挥抑制病络的作用。目前一些基础研究显示具备上述性味的中药能够抑制血管拟态的形成。南蛇藤(Celastrus Orbiculatus Thunb)系卫茅科藤属药用植物,全草入药,苦温微辛,入肝与膀胱经,功能行气活血、祛毒消肿。课题组前期的研究证实南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(Celastrus Orbiculatus Extraction,COE)能够抑制肝癌的内皮依赖性血管生成;抑制胃癌细胞的上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)减少胃癌裸鼠模型的转移。但是,关于COE能否调控Notch1抑制肝癌的血管拟态,目前未检索到相关的文献报道。为此,本研究围绕这一核心问题,从以下四个部分展开相应的研究,力图证实:1)Notch1在肝癌血管拟态中的作用及可能的机制;2)COE能否通过调控Notch1抑制血管拟态,进而抑制肝癌的生长。通过本课题的开展,以期为肝癌的中医药治疗提供理论及实验依据。本课题共分为四个研究部分。第一部分Notch1在肝癌组织中的表达及其与血管拟态的关系目的:检测Notch1及其下游靶蛋白Hes1、EMT相关蛋白E—cadherin及vimentin在肝癌组织中的表达水平,分析Notch1、EMT与肝癌VM的相关性;揭VM在肝癌进展预后中的临床意义。方法:收集肝癌手术标本,并根据标本来源信息对患者进行追踪随访。免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC)检测 Notch1、Hes1 及 EMT 相关蛋白的表达,以RT-PCR进行验证。PAS-CD34双染色检测VM,分析各蛋白表达水平与VM的相关性。应用Kaplan-Meier法绘制肝癌患者术后生存曲线,比较有无VM对术后复发的影响。结果:在收集的44例肝癌标本中,Notch1及Hes1在肝癌组织中的表达水平较癌旁组织明显上调(P<0.001)。共 17 例(38.64%,17/44)检出 VM 结构,Notch1、Hes1 的表达水平与 VM 检出率呈正性相关(r=0.590,0.568,P<0.001、0.001)。12 例(27.27%,12/44)检出肝癌细胞中vimentin表达,阳性率与VM呈正性相关(r=0.963,P<0.001)。Notch1表达水平在Vimentin阳性标本中显著提高(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析显示Notch1、Hes1表达升高及VM阳性提示肝癌术后早期复发。结论:VM的出现会提示肝癌术后的早期复发,Notch1表达上调与肝癌EMT转化及VM的形成存在相关性。第二部分Notch1对肝癌细胞体外血管拟态的影响目的:研究Notch1在肝癌细胞体外血管拟态中发挥的作用,探讨其促进肝癌细胞血管拟态的机制。方法:通过体外三维培养比较低侵袭人肝癌细胞HepG2和高侵袭人肝癌细胞MHCC97-H的小管形成能力,以RT-PCR及Western Blot比较两种细胞的Notch1转录及表达水平,确定实验靶细胞。继而以慢病毒载体表达技术实现HepG2细胞中Notch1过表达,MHCC97-H 细胞中 Notch1消减表达,获得 HepG2/Notch1+及 MHCC97-H/Notch1-转化细胞。通过三维培养比较转化细胞的血管拟态能力;以荧光标记的鬼笔环肽标记细胞F-actin骨架蛋白,以RT-PCR及Weatern Blot检测vimentin及E-cadherin的转录及表达,观察调控Notch1后肝癌细胞自身塑形的变化。最后,以TGF-β1诱导,观察Notch1表达水平与肝癌细胞VM形成及EMT的关系。结果:低侵袭潜能的HepG2细胞Notch1表达水平低于高侵袭潜能的MHCC97-H细胞,不具备体外VM形成能力。在HepG2细胞中过表达Notch1后细胞EMT潜能增加,获得体外VM形成能力;TGF-β1可以诱导HepG2细胞产生EMT,在此过程中Notch1表达水平升高并出现血管拟态。在高表达Notch1的MHCC97-H细胞中敲低Notch1,肝癌细胞EMT及VM形成潜能受抑,对TGF-β1诱导的EMT及VM形成反应性降低。结论:Notch1的表达上调可促进肝癌细胞的EMT,进而导致VM形成,下调Notch1可阻止肝癌细胞EMT,抑制肝癌细胞VM发育。第三部分Notch1在人肝癌裸鼠皮下移植瘤内血管拟态中的作用目的:从整体水平探讨Notch1与肝癌VM形成的关系。方法:应用本研究第二部分构建的转化细胞HepG2/vector、HepG2/Notch1 +、MHCC97-H/vector、MHCC97-H/Notch1-细胞分别接种至裸鼠左前腋下,形成不同人肝癌细胞系的裸鼠皮下移植瘤模型。每隔2d测量移植瘤长短径,绘制肿瘤生长曲线。造模后第28d活体荧光观察皮下移植瘤生长情况。处死动物,剥取移植瘤称重。移植瘤组织病理学观察;PAS-CD34双染色及透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察移植瘤内VM结构。免疫组织化学染色法检测移植瘤组织内EMT标志物vimentin及E-cadherin的表达。结果:HepG2/Notch1+移植瘤在造模后第20d生长加速,至实验结束时移植瘤体积及瘤质量均大于HepG2/vector;相反,MHCC97-H/Notch1-移植瘤在造模后第20d生长开始慢于MHCC97-H/vector,至实验结束时瘤体积及质量均小于MHCC97-H/vector。低表达Notch1的HepG2/vector和MHCC97-H/Notch1-移植瘤内点、片状坏死明显,未观察到典型的VM结构。免疫组化染色显示HepG2/Notch1+及MHCC97-H/vector移植瘤内肿瘤细胞vimentin着色强度及着色比例高于HepG2/vector及MHCC97-H/Notch1-移植瘤;相应的’E-cadherin的着色比例及强度在HepG2/Notch1+及MHCC97-H/vector移植瘤内也较低。结论:Notch1可促进人肝癌裸鼠皮下移植瘤中的VM形成,抑制Notch1表达可减少VM,抑制肿瘤生长。第四部分南蛇藤茎提取物调控Notch1抑制肝癌血管拟态目的:通过体外细胞实验及体内动物模型实验,证实南蛇藤茎提取物(COE)下调Notch1表达,抑制肝癌细胞EMT,减少VM形成,进而抑制肿瘤生长。方法:体外实验中,首先应用CCK-8及活细胞工作站分析COE对MHCC97-H细胞增殖及汇合的抑制,在后续的实验中选择低于IC50的三组COE浓度(20、40、80μg/mL)进行实验,阳性对照药物采用Notch1特异性阻断剂DAPT(5μM)。应用Transwell小室侵袭实验分析COE对MHCC97-H细胞及TGF-β1诱导的HepG2细胞的侵袭抑制;采用基质胶小管形成实验观察COE对MHCC97-H细胞及TGF-β1诱导的HepG2细胞VM形成抑制。RT-PCR及Western Blot分析COE干预后两种细胞Notch1、Hes1以及EMT标记物vimentin、E-cadherin的转录及表达水平;细胞骨架蛋白F-actin分布及表达采用荧光结合的鬼笔环肽标记。动物实验中应用GFP标记的MHCC97-H细胞接种裸鼠皮下形成人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,造模成功后COE20、40、80mg/kg每天1次灌胃给药,DAPT20mg/kg每天1次腹腔注射作为阳性对照,生理盐水为空白对照。每隔2d测量移植瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。第28d末次给药后活体荧光观察比较皮下移植瘤的荧光信号。剥取瘤组织后称重,切片病理观察。PAS-CD34双染色及TEM观察各组血管拟态结构。IHC检测COE各浓度对移植瘤组织中Notch1、Hes1及EMT相关蛋白vimentin、E-cadherin表达的影响。结果:COE呈浓度及时间依赖性方式抑制MHCC97-H细胞的增殖,作用MHCC97-H细胞 24h 的 IC50 为 145.88μg/mL。COE 各浓度(20、40、80μg/mL)及 DAPT(5μM)处理细胞24h可有效抑制MHCC97-H及TGF-β1诱导的HepG2细胞的侵袭及VM形成,COE80μg/mL浓度组作用接近DAPT效应。Notch1及其下游靶基因Hes1在COE作用后转录及表达水平下降;细胞骨架重塑及vimentin表达在COE作用后受到抑制。体内实验结果显示COE可抑制MHCC97-H皮下移植瘤的生长,减少移植瘤内拟态血管结构。瘤组织内Notch1、Hes1及vimentin表达水平在COE给药各组及DAPT组均有明显下降。结论:COE可抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长,其机制与下调Notch1表达,抑制肝癌EMT,减少VM形成有关。